早期食管癌 第一篇 早期食管癌 第一篇 第一章 早期食管癌的预测 第一章 早期食管癌的预测 第一节　绪　　论 食管癌（ esophageal carcinoma，EC）是一种常见的消化道肿瘤。 2018年全球食 管癌发病率为 6.3/100 000，在恶性肿瘤中居第 7位，死亡率为 5.5/100 000，在恶性肿 瘤中居第六位。［1］我国是食管癌高发国家， 2018年流行病学数据显示，我国食管癌发 病率为 13.9/100 000，死亡率为 12.7/100 000，我国新发病例和死亡病例占全球总数的 53.7%和 55.7%［2］。 显著的地域性分布是食管癌流行病学的突出特征，高、低发区发病率和死亡率相 差可达 500倍。河南省林州市（原河南省林县）和河北省磁县是我国食管癌发病最高 的地区，发病率超过 100/10万［3，4］；山东省肥城市也是我国食管癌高发区， 1970— 1974年食管癌死亡率为 63.19/10万，仅次于河南省林州市［4］；2014—2017年食管癌仍 是肥城市居民的第一大死因（ 56.01/10万）［5］。国内一项移民流行病学研究发现，河南 省林州市居民移居到山西省长治市 100年后，其自然人群食管癌检出率仍与河南省林 州市原居住地居民相似，这提示除自然因素之外，遗传因素可能在食管癌发生中起着 重要的作用。 在病理学上，食管癌可分为食管鳞状细胞癌（ esophageal squamous cell carcinoma， ESCC）和食管腺癌（ esophageal adenocarcinoma，EAC）。在北美地区， EAC占食管 癌的 80%；在我国， ESCC占食管癌的 90%，EAC仅占 10%。巴雷特食管（ Barrett esophagus，BE）是 EAC的癌前疾病。不论是由鳞状上皮还是柱状上皮发展而成的 食管恶性肿瘤，大部分都呈一个多阶段过程，正常黏膜经过不同程度的上皮异型增生 （dysplasia），最终发展为侵袭性癌；其中异型增生可分为三个级别，分别为低级别（轻 度）异型增生（ low-grade dysplasia，LGD）、中级别（中度）异型增生（ middle-grade dysplasia，MGD）和高级别（重度）异型增生（ high-grade dysplasia，HGD），其中 LGD和 MGD又称为低级别上皮内瘤变（low-grade intraepithelial neoplasia，LGIN），HGD 和原位癌称为高级别上皮内瘤变（ high-grade intraepithelial neoplasia，HGIN）。EC， 在发生异型增生前，往往还有基底细胞的增生和（或）炎症。在河南省高发区进行的 30～78个月随访研究发现，单纯炎症或增生患者的 EC发病率为 4.03%，而异型增生患 者的发病率高达 33.87%［6］。另一项长达 15年的随访研究发现，正常食管黏膜、 LGD、 MGD、HGD发展为 EC的概率分别为 2.4%、5.0%、8.3%、10.3%，依次增高［6］。 中晚期食管癌治疗花费大且效果差，总体 5年生存率为 15%～25%。发现早期食 第一章　.早期食管癌的预测003 管癌及癌前病变，进行早期治疗是改善食管癌预后，提高患者生存率及生存质量，降 低全球疾病负担的有效方法。目前早期食管癌和癌前病变的诊断主要建立在结合碘染 色、亚甲蓝染色等化学染色和窄带成像（narrow-band image，NBI）、联动成像（linked- color image，LCI）等光学染色的内镜筛查及靶向活检的基础上［1］。但内镜检查为侵入 性检查，部分患者存在检查禁忌，并且不同医生的检查质量不均一，这些因素限制了 内镜筛查及靶向活检的开展。 探寻环境因素与遗传易感性在食管癌发病中的机制及二者的相互作用，发现食管 癌的危险因素，筛选和建立用于早期诊断的生物学标记是当前肿瘤防治的热点。本章 将早期食管癌的危险因素和生物标志物两方面探讨食管癌的预测因子。 第二节　早期食管癌的危险因素 一、年龄和性别 大量研究发现EC的男性发病率高于女性，性别比为（1.3～3）∶1，中老年易患， 发病年龄多在50岁以上［7］。 针对太行山地区及江苏省多个食管癌高发区的研究均发现EC及其癌前病变的检 出率男性高于女性，且随年龄增长呈显著上升趋势［8-13］，在山东省肥城市的流行病学 研究中，以5岁为一年龄段的分组研究分析发现黏膜内癌检出率在50～54岁年龄组最 高，中、重度异型增生的检出率在55～59岁年龄组达到最高［10］；对哈萨克族的研究 也发现女性是EC的保护因素［11］。Krishnamoorthi等［14］纳入的9660例BE患者平均 随访4.8年的研究发现，EC的年发病率为2.23‰。男性是进展为EC的独立危险因素。 二、遗传因素 李琮宇［3］对河南省林州市及其毗邻的鹤壁、辉县等地为期10年的调查发现，EC 患者中有阳性家族史（连续三代内，食管癌患者≥2人）的约占1/3，一级亲属的遗传 度为51.41%，二级亲属的遗传度为31.16%；太行山地区、山东省肥城市及江苏扬中、 淮安等地的多项研究发现上消化道肿瘤家族史，尤其食管癌家族史是EC和癌前病变的 危险因素［4，8，9，14-16］。 三、饮食和营养因素 饮食因素对食管癌发生的影响，包括：①亚硝胺、黄曲霉毒素等致癌物的摄入； ②过烫、过硬食物引起的理化刺激；③饮食中一些营养素（如叶酸）的保护作用。 食管癌高发区的饮食习惯略有差异，但普遍发现霉变、烟熏及腌制食品、咸鱼、 第一章早期食管癌的预测 003 　. 管癌及癌前病变，进行早期治疗是改善食管癌预后，提高患者生存率及生存质量，降 低全球疾病负担的有效方法。目前早期食管癌和癌前病变的诊断主要建立在结合碘染 色、亚甲蓝染色等化学染色和窄带成像（narrow-band image，NBI）、联动成像（linked- color image，LCI）等光学染色的内镜筛查及靶向活检的基础上［1］。但内镜检查为侵入 性检查，部分患者存在检查禁忌，并且不同医生的检查质量不均一，这些因素限制了 内镜筛查及靶向活检的开展。 探寻环境因素与遗传易感性在食管癌发病中的机制及二者的相互作用，发现食管 癌的危险因素，筛选和建立用于早期诊断的生物学标记是当前肿瘤防治的热点。本章 将早期食管癌的危险因素和生物标志物两方面探讨食管癌的预测因子。 第二节　早期食管癌的危险因素 一、年龄和性别 大量研究发现 EC的男性发病率高于女性，性别比为（ 1.3～3）∶1，中老年易患， 发病年龄多在 50岁以上［7］。 针对太行山地区及江苏省多个食管癌高发区的研究均发现 EC及其癌前病变的检 出率男性高于女性，且随年龄增长呈显著上升趋势［8-13］，在山东省肥城市的流行病学 研究中，以 5岁为一年龄段的分组研究分析发现黏膜内癌检出率在 50～54岁年龄组最 高，中、重度异型增生的检出率在 55～59岁年龄组达到最高［10］；对哈萨克族的研究 也发现女性是 EC的保护因素［11］。Krishnamoorthi等［14］纳入的 9660例 BE患者平均 随访 4.8年的研究发现，EC的年发病率为 2.23‰。男性是进展为 EC的独立危险因素。 二、遗传因素 李琮宇［3］对河南省林州市及其毗邻的鹤壁、辉县等地为期 10年的调查发现， EC 患者中有阳性家族史（连续三代内，食管癌患者 ≥2人）的约占 1/3，一级亲属的遗传 度为 51.41%，二级亲属的遗传度为 31.16%；太行山地区、山东省肥城市及江苏扬中、 淮安等地的多项研究发现上消化道肿瘤家族史，尤其食管癌家族史是 EC和癌前病变的 危险因素［4，8，9，14-16］。 三、饮食和营养因素 饮食因素对食管癌发生的影响，包括：①亚硝胺、黄曲霉毒素等致癌物的摄入； ②过烫、过硬食物引起的理化刺激；③饮食中一些营养素（如叶酸）的保护作用。 食管癌高发区的饮食习惯略有差异，但普遍发现霉变、烟熏及腌制食品、咸鱼、 油炸食品会增加 EC发病的风险；不按时就餐、进食过快、生硬食物、过烫食物（如江 苏泰兴流行饮用高温绿茶）也会增加 EC的风险；研究提示，食用红肉、加工肉类以及 缺乏纤维素和维生素 C会增加 EC患病风险，而大豆、鱼类、油类、芹菜、茄子、芸 豆、青椒、脂肪、粗纤维素（如韭菜）具有保护作用［3，4，6，12，16-18］。 多个独立研究及一项 meta分析均提示膳食叶酸摄入量及血清叶酸水平与 EC的发生 有关，这种情况不仅存在于汉族人群中，也存在于哈萨克族人群中［11，17，20］。叶酸代谢 酶 MTR A2756G基因多态性及叶酸相关基因的甲基化水平与 EC的发病有关，并与病理 分型、浸润程度及 TNM分期相关。研究发现检测癌组织、癌旁组织中叶酸受体 α的表 达水平还有助于判断食管癌肿瘤病变范围，具有指导手术治疗的意义［21］。血清中维生素 B2、维生素 B6、维生素 B12水平在 EC癌前病变患者与正常对照组间无显著性差异［17］。 四、吸烟和饮酒 目前的研究结果一致提示吸烟是食管癌的危险因素［3，4，6，15，19］，即吸烟会增加 EC及其癌前病变的发生风险；饮酒对食管癌发病的影响，目前结果尚不一致。杨艳芳 等［4］发现饮酒为异型增生的危险因素；张立玮［8］对太行山地区食管癌的研究发现饮 酒史与食管癌检出率无关；杨孝荣［19］的研究表明，饮酒与吸烟共同暴露时，会显著增 加男性患食管鳞癌的风险，且与患食管鳞癌风险呈正向的剂量反应关系。 五、上消化道疾病史 研究发现，既往消化系统疾病史，如胃十二指肠溃疡、食管炎病史是 EC及其癌前 病变的危险因素［16，17］。 六、微生物感染 Li等［22］将 187例 ESCC患者手术切除标本提取癌变组织的全基因组，用含有人类 乳头状瘤病毒（ human papillomavirus，HPV）基因的引物进行 PCR检测，发现 168例 呈现 HPV阳性，其中 76例为 HPV16阳性， 76例中的 74例都存在基因的融合，提示 HPV16持续感染可能是 EC的致病因子。 上消化道的微生态群可能参与胃食管反流病（ gastroesophageal reflux disease， GERD）、BE、EAC的病理生理过程，有研究表明导致胃内硝酸盐减少的弯曲菌属 可能参与 BE的发生、恶化以及进展为 EAC的过程；研究表明，根除幽门螺杆菌 （Helicobacter pylori，简称 H. pylori）可以改善食管反流症状和食管炎，而不同于过去 人们理解的 H. pylori感染对 GERD有“保护”的作用。因此，可能要从细菌和宿主的 交互作用的角度来理解 H. pylori对 GERD及 BE、EAC的影响， H. pylori感染与 EAC 的关系仍需进一步探讨［23］。 第一章早期食管癌的预测 005 　. 七、精神心理因素 有研究发现精神刺激、经常生闷气、性格内向是 EC发生的危险因素［3］；EC高发 与人年均收入低有关［17］。 八、体重因素 Krishnamoorthi等［14］的研究发现体重超重（BMI 25～29.9）是 BE进展为 EC的独 立危险因子，而他汀类药物和质子泵抑制剂（ PPI）是保护因子。 BE为 GERD的继发 事件， PPI可以减轻食管炎症，进而减缓疾病的进展；他汀类药物的保护作用与体重超 重的促疾病进展作用，则提示代谢综合征可能是引发 EC的潜在因素。杨孝荣等［19］的 研究发现，在体重过轻和体重正常的人群中，体重减轻会促进 ESCC的发生，体重增 加可降低 ESCC的发生，超重和肥胖人群没有显著影响，这些仍需更大样本研究来验 证并对潜在机制进行探讨。 第三节　早期食管癌的生物标志物预测 一、癌基因 1．p53基因 p53基因是重要的抑癌基因，通过启动基因修复使细胞程序性凋亡，防止受损伤 的细胞增殖。 p53突变主要是基因突变和杂合性缺失， p53蛋白是由 p53基因编码，参 与正常细胞有丝分裂的关键蛋白质，正常细胞中含量较少，当细胞遭受紫外线辐射、 DNA损伤等情况时， p53蛋白可以介导细胞发生周期性停滞和凋亡等，起到消灭异 常细胞的作用。 Kaye P. V. 等［24］应用 IHC检测 p53蛋白，发现其在食管腺癌癌前病 变，尤其是低级别异型增生的诊断中可发挥辅助作用。 Zhao等［25］在研究中指出， p53 Arg72Pro多态性与食管癌发生风险的增加有关（ Pro/Arg＋Pro/Pro vs Arg/Arg，OR＝ 1.20，95% CI：1.06～1.36），尤其是在亚洲人群中。虽然 p53蛋白尚未被批准用于临床 检测，但有成为诊断食管癌癌前病变分子标志物的潜力。 2．CYP450基因 CYP450是一种以铁原叶琳为辅基的 B族细胞色素，与机体的耐药性和疾病的发 生有密切联系，影响个体对肿瘤的易感性。 CYP1A1 Ile/Val多态性与食管癌的发生有 关，Yun等［26］的病例对照研究结果提示， CYP1A1 Ile/Val多态性，与野生型 Ile/Ile比 较，杂合子基因型 Ile/Val和组合变异基因型 Ile/Val＋Val/Val增加了食管癌的发生风险 （OR＝2.05，95% CI：1.19～3.54；OR＝1.86，95% CI：1.11～3.12）。 3．PTEN 基因 PTEN位于 10号染色体，包含多个重要的结构域，其中 C2结构域参与了膜定位 功能，在肿瘤的发生、发展以及临床预后等过程中发挥重要作用，且 C2结构域也具有 抑制肿瘤的作用。 Sun Z.等［27］的研究发现食管癌患者肿瘤细胞核中 PTEN基因高表达 患者的生存率比低表达者生存率高，食管癌患者细胞核中 PTEN基因的表达情况是食 管癌肿瘤细胞侵袭能力、肿瘤迁移的重要指标。 4．NOTCH1基因 NOTCH1基因是食管癌细胞中突变频率最高的原癌基因，位于 9号染色体（ 9q34.3）， NOTCH1基因编码的蛋白属于Ⅰ型跨膜蛋白家族成员，具备核转录过程中的调控作用。 NOTCH1 通路作用机制是通过上皮细胞间质转化（ EMT）过程参与食管癌的病理变化 过程。在食管癌中， NOTCH1突变频率为 8%～21%。Song B. 等研究发现 NOTCH1基 因突变与食管癌细胞的分化程度、肿瘤进展速度以及淋巴结转移等密切相关，携带该 基因突变的患者临床治疗效果较差［28］。 5．PIK3CA基因 PIK3CA基因其位于第 3号染色体（ 3q26区），其编码的蛋白质 p110α是磷脂酰肌 醇 3激酶的催化性亚基， PIK3CA突变类型主要是错义突变，集中在 9外显子、 20外 显子。在食管癌肿瘤细胞中，突变率为 2.2%～21.0%，Hou J. 等研究发现，与 PIK3CA 第 9外显子和（或）第 20号外显子突变患者相比，野生型患者具有更好的临床治疗效 果和无瘤生存期［29］。 6．XRCC1基因 XRCC1基因位于 19号染色体（ 19q13.2～13.3），在结构上有 17个外显子组成，编码 的蛋白质在 DNA发生损伤时与之结合，并联合 DNA聚合酶 beta、PNK以及 DNAL连接 酶Ⅲ等酶修复组件，修复受损 DNA。Wei B. 等研究发现，部分食管癌患者 XRCC1基因高表 达，并且这部分患者预后较差，XRCC1高表达是影响患者临床生存期的独立危险因素［30］。 7．CCND1基因 细胞周期蛋白家族参与细胞周期进程，尤其是 CCND1主要的调节蛋白，其通过与 细胞周期蛋白依赖性激酶 4和细胞周期蛋白依赖性激酶 6结合，在促进 G1期向 S期过 渡中发挥关键作用。 Wen L.等研究发现， CCND1 G870A多态性是食管癌发生、发展 过程中的一个危险因素（A vs G，OR＝1.23，95% CI：1.02～1.48，P＝0.029）［31］。 8．MTHFR基因 MTHFR催化叶酸生物转化形成甲基供体的关键酶， MTHFR基因有两个常见的 单核苷酸多态，即 677C/T和 1298A/C，这两个突变均导致 MTHFR活性明显降低。 Mazzuca F. 等［32］的研究发现， MTHFR C677T基因多态性与食管癌的发生有关，携带 TT等位基因的个体有更高的发病风险（OR＝2.35，95% CI：1.24～4.46，P＝0.036）。 二、蛋白标记 在食管癌发生过程中，除癌基因与抑癌基因外，一些细胞功能蛋白和血清酶类及 第一章　.早期食管癌的预测007 免疫相关蛋白也存在表达增加，也可作为早期食管癌诊断和预后的预测因子。 （一）D-二聚体 多数恶性肿瘤患者存在凝血及纤溶系统的异常。周保林［33］等研究发现诊断食管 癌D-二聚体灵敏度为38.24%，4种常用肿瘤标志物（CYFRA21-1、CEA、CA19-9和 CA72-4）诊断食管癌的灵敏度分别为56.62%、21.32%、16.91%和14.71%；4种肿瘤 标志物联合检测时的灵敏度66.91%，而D-二聚体联合4种标志物灵敏度为78.68%， 提示D-二聚体与常用肿瘤标志物联合检测可提高食管癌的检出率，可以为食管癌的临 床筛查提供一定的依据。 （二）肿瘤抗原的自身抗体 癌基因及抑癌基因突变后，异常表达的蛋白为肿瘤抗原，其一般浓度较低，而针 对肿瘤抗原的自身抗体，其检测具有更高的敏感性。皇甫明美［34］检测了食管癌患者 血清中EZH2、Bmi-1、P16、IMP-1和Survivin自身抗体表达的变化，其中，P16和 Survivin自身抗体表达显著升高，但不如肺癌明显，分析受试人群ROC曲线发现，在 特异度90%情况下，P16和Survivin食管癌检出的敏感度分别为26%和15%，可以作 为食管癌辅助诊断的参考指标。 （三）肿瘤分化指标 Zhang等［35］的研究发现，在73例食管小细胞癌患者的石蜡包埋标本中，突触素 （synaptophysin，Syn）、甲状腺转录因子-1（thyroid transcriptional factor-1，TTF- 1）、神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、嗜铬粒蛋白A（chromogranin A，CagA）的阳性率分别为68.5%、49.3%、90.4%和43.8%；表达阳性的患者预后优 于全部阴性的患者。 （四）免疫相关蛋白Tim-3 免疫监视功能的失调在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。Tim-3首先被发现 在Th1细胞表面表达，能够抑制免疫应答，参与诱导免疫耐受，是调节T细胞免疫应 答的关键分子，在慢性病毒感染和肿瘤中，其持续表达导致T细胞功能耗竭［36］。研究 发现在食管癌患者肿瘤组织中，T细胞表达水平较高，Tim-3和T细胞功能呈耗竭状 态，在食管癌微环境中，T细胞表面Tim-3的表达与淋巴结转移、临床分期密切相关， Tim-3有可能成为一个潜在的食管癌治疗靶点。 三、表观遗传学标记 表观遗传学标记（DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、非编码RNA等）的 改变是肿瘤发生的重要原因。 第一章　.早期食管癌的预测007 免疫相关蛋白也存在表达增加，也可作为早期食管癌诊断和预后的预测因子。 （一）D-二聚体 多数恶性肿瘤患者存在凝血及纤溶系统的异常。周保林［33］等研究发现诊断食管 癌D-二聚体灵敏度为38.24%，4种常用肿瘤标志物（CYFRA21-1、CEA、CA19-9和 CA72-4）诊断食管癌的灵敏度分别为56.62%、21.32%、16.91%和14.71%；4种肿瘤 标志物联合检测时的灵敏度66.91%，而D-二聚体联合4种标志物灵敏度为78.68%， 提示D-二聚体与常用肿瘤标志物联合检测可提高食管癌的检出率，可以为食管癌的临 床筛查提供一定的依据。 （二）肿瘤抗原的自身抗体 癌基因及抑癌基因突变后，异常表达的蛋白为肿瘤抗原，其一般浓度较低，而针 对肿瘤抗原的自身抗体，其检测具有更高的敏感性。皇甫明美［34］检测了食管癌患者 血清中EZH2、Bmi-1、P16、IMP-1和Survivin自身抗体表达的变化，其中，P16和 Survivin自身抗体表达显著升高，但不如肺癌明显，分析受试人群ROC曲线发现，在 特异度90%情况下，P16和Survivin食管癌检出的敏感度分别为26%和15%，可以作 为食管癌辅助诊断的参考指标。 （三）肿瘤分化指标 Zhang等［35］的研究发现，在73例食管小细胞癌患者的石蜡包埋标本中，突触素 （synaptophysin，Syn）、甲状腺转录因子-1（thyroid transcriptional factor-1，TTF- 1）、神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、嗜铬粒蛋白A（chromogranin A，CagA）的阳性率分别为68.5%、49.3%、90.4%和43.8%；表达阳性的患者预后优 于全部阴性的患者。 （四）免疫相关蛋白Tim-3 免疫监视功能的失调在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。Tim-3首先被发现 在Th1细胞表面表达，能够抑制免疫应答，参与诱导免疫耐受，是调节T细胞免疫应 答的关键分子，在慢性病毒感染和肿瘤中，其持续表达导致T细胞功能耗竭［36］。研究 发现在食管癌患者肿瘤组织中，T细胞表达水平较高，Tim-3和T细胞功能呈耗竭状 态，在食管癌微环境中，T细胞表面Tim-3的表达与淋巴结转移、临床分期密切相关， Tim-3有可能成为一个潜在的食管癌治疗靶点。 三、表观遗传学标记 表观遗传学标记（DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、非编码RNA等）的 改变是肿瘤发生的重要原因。 （一）DNA甲基化 1．DNA甲基化的定义 DNA甲基化是指 DNA在甲基转移酶的作用下，以 S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体， 将甲基与基因 CpG二核苷酸中的胞嘧啶结合，形成 5′-甲基胞嘧啶。癌变组织往往表 现为全基因组序列的低甲基化及启动子区域的高甲基化。无论是组织 DNA还是外周血 DNA都可以用于甲基化检测［37］，甲基化特异性 PCR（MSP）技术敏感度高，可以将 1 个甲基化的 DNA拷贝从混有 1000个非甲基化的 DNA拷贝中检测出来，已成为 DNA 甲基化检测的常用方法［38］。 2．抑癌基因甲基化 p16［39］、ENG［40］、HIN［41］、SOX17［42］和 TAC1［43］等抑癌基因启动子甲基化改 变往往发生在早期 ESCC，甚至在异型增生等食管癌癌前病变中出现，并且甲基化程度 随着疾病的进展而升高，提示这些抑癌基因的启动子甲基化检测结果可以用于食管鳞 癌的早期诊断。 CDH1和 ITGA4基因启动子高甲基化与食管鳞癌的临床分期有重要关系，这两个 基因的高甲基化状态分别与Ⅰ期和Ⅱ期食管鳞癌患者术后较高的复发风险以及较低的 无病生存率高度相关。 有研究表明 PLCD1在食管癌中发挥抑癌基因的作用，它通过 p-Cofilin/PKCa通路 抑制食管癌细胞的伪足形成，从而抑制食管癌细胞的迁移， PLCD1启动子区高甲基化 后在食管癌中低表达［44］。 甄玉洁［11］等对哈萨克族 EC患者的研究发现抑癌基因 MGMT、P16、FHIT、 RASSF1A甲基化状态与食管癌的发生密切相关，并且 CBS和 RASSF1A基因甲基化是 影响 ESCC预后的独立危险因素。 Fornah Lovel［45］对江苏省淮安地区 110例食管癌患者的研究发现，抑癌基因 MGMT甲基化可能会增加 EC的发病风险，血液 MGMT甲基化可作为早期无创检测 EC的候选生物标志物。在 ESCC中，细胞黏附相关蛋白 CDH17的 CpG岛甲基化状态 增强，CDH17表达水平降低。 联合检测多基因甲基化将来可能用于食管鳞癌的早期诊断、鉴别诊断和预后评估。 另外，表观遗传学所导致的基因表达改变，可以通过一定的方法使之恢复正常表达， 为肿瘤的防治提供了一条新的思路。 （二）长链非编码 RNA 长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度为 200～100 000个 碱基的核苷酸（ nucleotide，nt），但不编码蛋白质的 RNA分子。人类基因组中约 98% 的基因转录成了非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA），目前已知的 ncRNA有 76% 被转录成 lncRNA并且具有组织特异性［46，47］。lncRNA虽然不编码蛋白质，在转录沉 默、转录激活、染色体修饰、核内运输等方面均具有重要功能， lncRNA参与调控肿瘤 第一章　.早期食管癌的预测009 细胞的各种生物学行为，包括肿瘤生长、侵袭、转移等。目前，有大量与食管癌相关 的lncRNA被鉴定出来，它们广泛存在于血清、血浆、尿液和脑脊液等体液中，与食 管癌的发生和发展有密切关系［48］。 1996年，Hibi等［49］报道在食管肿瘤中发现lncRNA H19，但未提及是在ESCC组 织标本，还是EAC组织标本中发现。在正常情况下，H19等位基因如果来自父系，呈 甲基化状态，如果来自母系，则呈去甲基或低甲基化状态，保证H19基因可转录为 2300碱基的RNA分子。H19和IGF2均位于11号染色体，二者的表达水平呈反向趋 势，lncRNA H19表达抑制IGF2表达，lncRNA H19表达降低，则IGF2表达增加。 lncRNA AFAP1-AS1含有6810个碱基，指位于编码肌动蛋白相关蛋白1的位点 （actin filament-associated protein 1，AFAP1）的反义或非编码DNA链，AFAP1与原 癌基因SRC相互作用，调控肌动蛋白的完整性。研究发现lncRNA AFAP1-AS1在巴 雷特食管组织及3个EAC细胞株中的表达显著升高，用siRNA沉默EAC细胞株的 lncRNA AFAP1-AS1，可以显著减弱其迁移及侵犯能力，提示AFAP1-AS1起类似癌基 因的作用，促进EAC的发生［50］。Luo等［51］对65例ESCC患者组织标本的研究也发 现AFAP1-AS1表达升高。 Huang等［52］对132例食管癌组织标本的研究发现lnc MALAT1（metastasis- associated lung adenocarcinoma transcript 1，转移相关肺腺癌转录因子1）的表达水平较 正常组织显著升高，且和淋巴侵犯、远处转移和细胞分化水平相关，是不良预后的预 测因子。 何庆军等［53］研究发现位于染色体1q23上的lnc01133在ESCC总的相对表达量明 显低于正常组织，它可能作为肿瘤抑制因子，在早期食管癌的进展中发挥重要作用， 并且发现lnc01133在ESCC患者中的预后判断的意义受患者饮酒行为的影响。 王彪等［54］研究发现位于染色体7p15.2上的lncRNA HOXA11-AS在ESCC组织和 三种人源ESCC细胞系中均明显高表达，且其高表达水平与ESCC肿瘤分期和淋巴结 转移显著相关。 尚牧禾等［55］研究发现lncRNA-ROR，在ESCC组织中与癌旁组织的表达水平显著增 高，在食管癌细胞株中表达显著高于正常食管细胞，其作用机制可能为作为miRNA分子 海绵竞争性结合miR-145、miR-204等miRNA并抑制其功能，以此减少FSCN1、MDM2等 癌基因mRNA的降解；通过ROR/miR-145/FSCN1通路增强食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能 力，并可通过ROR/miR-204/MDM2通路抑制P53通路，进而促使细胞由G1期进入S期。 Ma等［56］研究TCGA数据库发现在73个功能性lncRNA里，lnc DLEU2与EAC 的总生存时间（overall survival，OS）相关，与邻近的正常组织相比，DLEU2与其内 含子miR-15a和miR-16-1在EAC组织内高表达，但单因素及多因素分析表明，lnc DLEU2而非miR-15a或miR-16-1是EAC患者OS的预测因子（HR：1.970，95% CI： 1.266～3.067，p＝0.003），进一步研究发现DLEU2的外显子9与DLEU2共表达，是 EAC患者OS不佳的预测因子。 蛋白编码基因（protein coding gene，PCGs）与lncRNA在肿瘤的发生中均发挥重 第一章　.早期食管癌的预测009 细胞的各种生物学行为，包括肿瘤生长、侵袭、转移等。目前，有大量与食管癌相关 的lncRNA被鉴定出来，它们广泛存在于血清、血浆、尿液和脑脊液等体液中，与食 管癌的发生和发展有密切关系［48］。 1996年，Hibi等［49］报道在食管肿瘤中发现lncRNA H19，但未提及是在ESCC组 织标本，还是EAC组织标本中发现。在正常情况下，H19等位基因如果来自父系，呈 甲基化状态，如果来自母系，则呈去甲基或低甲基化状态，保证H19基因可转录为 2300碱基的RNA分子。H19和IGF2均位于11号染色体，二者的表达水平呈反向趋 势，lncRNA H19表达抑制IGF2表达，lncRNA H19表达降低，则IGF2表达增加。 lncRNA AFAP1-AS1含有6810个碱基，指位于编码肌动蛋白相关蛋白1的位点 （actin filament-associated protein 1，AFAP1）的反义或非编码DNA链，AFAP1与原 癌基因SRC相互作用，调控肌动蛋白的完整性。研究发现lncRNA AFAP1-AS1在巴 雷特食管组织及3个EAC细胞株中的表达显著升高，用siRNA沉默EAC细胞株的 lncRNA AFAP1-AS1，可以显著减弱其迁移及侵犯能力，提示AFAP1-AS1起类似癌基 因的作用，促进EAC的发生［50］。Luo等［51］对65例ESCC患者组织标本的研究也发 现AFAP1-AS1表达升高。 Huang等［52］对132例食管癌组织标本的研究发现lnc MALAT1（metastasis- associated lung adenocarcinoma transcript 1，转移相关肺腺癌转录因子1）的表达水平较 正常组织显著升高，且和淋巴侵犯、远处转移和细胞分化水平相关，是不良预后的预 测因子。 何庆军等［53］研究发现位于染色体1q23上的lnc01133在ESCC总的相对表达量明 显低于正常组织，它可能作为肿瘤抑制因子，在早期食管癌的进展中发挥重要作用， 并且发现lnc01133在ESCC患者中的预后判断的意义受患者饮酒行为的影响。 王彪等［54］研究发现位于染色体7p15.2上的lncRNA HOXA11-AS在ESCC组织和 三种人源ESCC细胞系中均明显高表达，且其高表达水平与ESCC肿瘤分期和淋巴结 转移显著相关。 尚牧禾等［55］研究发现lncRNA-ROR，在ESCC组织中与癌旁组织的表达水平显著增 高，在食管癌细胞株中表达显著高于正常食管细胞，其作用机制可能为作为miRNA分子 海绵竞争性结合miR-145、miR-204等miRNA并抑制其功能，以此减少FSCN1、MDM2等 癌基因mRNA的降解；通过ROR/miR-145/FSCN1通路增强食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能 力，并可通过ROR/miR-204/MDM2通路抑制P53通路，进而促使细胞由G1期进入S期。 Ma等［56］研究TCGA数据库发现在73个功能性lncRNA里，lnc DLEU2与EAC 的总生存时间（overall survival，OS）相关，与邻近的正常组织相比，DLEU2与其内 含子miR-15a和miR-16-1在EAC组织内高表达，但单因素及多因素分析表明，lnc DLEU2而非miR-15a或miR-16-1是EAC患者OS的预测因子（HR：1.970，95% CI： 1.266～3.067，p＝0.003），进一步研究发现DLEU2的外显子9与DLEU2共表达，是 EAC患者OS不佳的预测因子。 蛋白编码基因（protein coding gene，PCGs）与lncRNA在肿瘤的发生中均发挥重 要作用。 Guo等［57］研究发现 PCGs与 lncRNA结合可以更准确地预测食管癌的 OS； 发现 3种 PCGs（ANGPTL7、OBP2A、SLC27A5）和 2种 lncRNAs（RP11-702B10.1、 RP11-523H24.3）的准确率最高（训练组 AUC为 0.85，测试组 AUC为 0.63），PCGlncRNA 联合指标可作为 TNM分期的预后辅助预测因子。 一项 meta分析检测了 7组来自正常食管、 BE、EAC和 ESCC组织的 RNA表 达数据。这项研究评估了差异表达的 PCGs及其与非编码 lncRNAs53的关系。本研 究发现配对的 lncRNA和 PCGs的数量差异很大。 BE与正常食管的特异配对数量为 2690对，EAC与 BE的特异配对数量为 29对，EAC与正常食管特异配对 2000对， ESCC与正常食管特异配对 19 815对。但需要注意，该结论是基于不同研究小组的 几个不同的实验数据。 EAC/BE和 ESCC/正常食管之间的 lncRNA和 PCGs对数量存 在很大差异，提示 EAC和 ESCC是不同的疾病类型，涉及的 lncRNA表达和功能也 不同［58］。 Tong等［59］检测 10种以前发现的与 ESCC相关的 lncRNA（HOTAIR、AFAP1AS1 、POU3F3、HNF1A-AS1、91H、PlncRNA1、SPRY4-IT1、ENST00000435885.1、 XLOC_013104和 ENST00000547963.1）在血浆（或血清）中的水平，发现 ESCC相 关的 lncRNA在肿瘤患者的血清中可测及且浓度稳定。这些 lncRNA大部分来源于肿 瘤细胞， ESCC患者血浆 POU3F3、HNF1A-AS1和 SPRY4-IT1水平较正常对照组显著 增高。根据受试者工作特性曲线（ receiver operating characteristic curve，ROC），在这 3种 lncRNA中，血浆 POU3F3的诊断效力最佳： AUC为 0.842，敏感性 72.8%，特异 性 89.4%；POU3F3和 SCCA联合检测， AUC为 0.926，诊断的敏感性和特异性分别为 85.7%和 81.4%，有利于早期诊断。 另一项研究也发现循环 lncRNA可作为早期 ESCC的生物标志物。这项研究采用 了 lncRNA芯片筛选、多级验证和风险分析的方法，通过 205例 ESCC患者、 82例食 管异型增生患者和 210例健康对照患者的队列研究，证实升高的， lnc00152、CFLARAS1 和 POU3F3可作为潜在的生物标志物和早期进展的预测指标， AUC分别为 0.698、 0.651和 0.584。3种 lncRNA联合，AUC为 0.765，再联合 CEA可达到 0.955［60］。 转录组（ transcriptome）研究是借助 RNA测序技术，寻找肿瘤生物标志物的方 法。在 Maag J. L.等［61］的研究中，收集了 51例内镜活检组织标本：正常食管鳞状上皮 （normal squamous esophagus，NE）17例，无异型增生的 BE（non-dysplastic BE，NDBE） 14例，合并低级别异型增生的 BE 8例，EAC 12例；进行 RNA测序（ RNA sequencing， RNA-seq），并再收集 15例患者（ NE 5例、NDBE 5例、EAC 5例）进行免疫组化检 测，以确定蛋白质表达情况；发现了新的 EAC驱动基因，主要涉及关键细胞周期和 DNA基因修复，如 BRCA1和 PRKDC，发现了 4个可鉴别 EAC与 BE的新基因标签 （CTSL、COL17A1、KLF4、E2F3）；发现了 685个表达发生变化的 lncRNA及在 BE进 展为 EAC过程中下调的重复原件“ Alu”；发现在 BE进展为 EAC过程中存在合并和不 合并 P53途径的通路突变。 Yang等［62］通过对匹配的正常组织、 BE组织和 EAC组织进行 RNA-seq分析，研 第一章　.早期食管癌的预测011 究了正常食管组织向EAC进展过程中表达的lncRNA，最终鉴定出6216个在EAC中 表达的lncRNA。与正常食管组织相比，EAC中有61个lncRNA表达上调，平均上调 幅度超过8倍。他进一步研究了lnc HNF1A-AS1，它位于反义DNA链上，有2455个 碱基，是肝核因子1-α基因（HNF1A）的共轭基因。HNF1A-AS1在4个EAC细胞系 中过表达；siRNA介导的HNF1A-AS1下调降低了EAC细胞的增殖，降低了与锚定无 关的生长。这些实验还表明，敲除HNF1A-AS1的siRNA后，EAC细胞系的细胞迁移 和侵袭能力降低。令人惊讶的是，与正常食管组织相比，EAC中的HNF1A mRNA及 蛋白显著上调，但HNF1A-AS1并不直接调控HNF1A mRNA/蛋白。lncRNA H19是 HNF1A-AS1基因敲除后调控最明显的基因；这些lncRNA之间的相关性在原发性EAC 中得到了证实。因此，lncRNA HNF1A-AS1可能作为EAC侵袭性的标志。 Xiong等［63］通过57个基因芯片及RNA-seq数据库发现lncRNA NEAT1在消化系 统不同类型肿瘤内表达不一致，它在胰腺癌组织表达上调，在肝癌和食管癌细胞表达下 调，提示其在不同器官可能发挥不同的作用，可能作为诊断的生物标记和治疗的靶点。 （三）微小RNA 1993年，Lee等在秀丽隐杆线虫中发现了一类新的小分子ncRNA（19～23个碱 基）。2001年，这种小分子RNA在人体内得到证实存在，称为microRNA。可简写为 miRNA。哺乳动物大约有2000个miRNA，每个miRNA有多个信使RNA（messenger RNA，mRNA）靶点，通过对靶基因转录后水平的负调控，几乎参与体内所有的基本 信号转导途径。miRNA表达水平的改变与食管癌的发生、发展、诊断、化疗耐药性、 放疗敏感性和预后判断有着密不可分的关系。 杨成梁等［64］的研究发现miR-135通过调控Smo基因增加食管鳞癌上EMT和诱导 放疗抵抗的产生。 刘梦歆等［65］通过食管癌细胞RNA的Solexa高通量测序和miRDeep2软件预测， 发现了新的候选miRNA。他通过荧光定量PCR实验发现，与癌旁组织相比，novelmiR- 4885、novel-miR-7121、novel-miR-21009在EC组织中显著高表达，logistic回归分析 发现这3个miRNA表达升高显著增加了食管癌的发病风险，是食管癌的危险因素。 陈剑峰等［66］发现EC组织中miR-203表达水平明显低于癌旁正常组织，miR-21 表达水平明显高于癌旁正常组织，二者表达的水平呈负相关，且各与食管癌临床分期、 肿瘤分化程度、淋巴结转移及患者的生存率密切相关，而与食管癌患者年龄、性别、 肿瘤部位无明显相关性。 Lin等［67］发现与邻近正常组织相比，EAC、ESCC均有明显的miR-421表达上调， 并且miR-421的表达上调与EAC更短的OS有关，对ESCC无相关的预测作用。 Yang等［68］的一项Meta分析发现miRNA-15a作为抑癌因子，其下调与膀胱癌、 头颈癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤较低的OS相关，但在EC表现为相反结果（HR＝0.53，95%CI 0.34～0.85；p＝0.0072）。 Hong等［69］通过TCGA（Cancer Genome Atlas）数据库研究发现miR-550a高表达 第一章　.早期食管癌的预测011 究了正常食管组织向EAC进展过程中表达的lncRNA，最终鉴定出6216个在EAC中 表达的lncRNA。与正常食管组织相比，EAC中有61个lncRNA表达上调，平均上调 幅度超过8倍。他进一步研究了lnc HNF1A-AS1，它位于反义DNA链上，有2455个 碱基，是肝核因子1-α基因（HNF1A）的共轭基因。HNF1A-AS1在4个EAC细胞系 中过表达；siRNA介导的HNF1A-AS1下调降低了EAC细胞的增殖，降低了与锚定无 关的生长。这些实验还表明，敲除HNF1A-AS1的siRNA后，EAC细胞系的细胞迁移 和侵袭能力降低。令人惊讶的是，与正常食管组织相比，EAC中的HNF1A mRNA及 蛋白显著上调，但HNF1A-AS1并不直接调控HNF1A mRNA/蛋白。lncRNA H19是 HNF1A-AS1基因敲除后调控最明显的基因；这些lncRNA之间的相关性在原发性EAC 中得到了证实。因此，lncRNA HNF1A-AS1可能作为EAC侵袭性的标志。 Xiong等［63］通过57个基因芯片及RNA-seq数据库发现lncRNA NEAT1在消化系 统不同类型肿瘤内表达不一致，它在胰腺癌组织表达上调，在肝癌和食管癌细胞表达下 调，提示其在不同器官可能发挥不同的作用，可能作为诊断的生物标记和治疗的靶点。 （三）微小RNA 1993年，Lee等在秀丽隐杆线虫中发现了一类新的小分子ncRNA（19～23个碱 基）。2001年，这种小分子RNA在人体内得到证实存在，称为microRNA。可简写为 miRNA。哺乳动物大约有2000个miRNA，每个miRNA有多个信使RNA（messenger RNA，mRNA）靶点，通过对靶基因转录后水平的负调控，几乎参与体内所有的基本 信号转导途径。miRNA表达水平的改变与食管癌的发生、发展、诊断、化疗耐药性、 放疗敏感性和预后判断有着密不可分的关系。 杨成梁等［64］的研究发现miR-135通过调控Smo基因增加食管鳞癌上EMT和诱导 放疗抵抗的产生。 刘梦歆等［65］通过食管癌细胞RNA的Solexa高通量测序和miRDeep2软件预测， 发现了新的候选miRNA。他通过荧光定量PCR实验发现，与癌旁组织相比，novelmiR- 4885、novel-miR-7121、novel-miR-21009在EC组织中显著高表达，logistic回归分析 发现这3个miRNA表达升高显著增加了食管癌的发病风险，是食管癌的危险因素。 陈剑峰等［66］发现EC组织中miR-203表达水平明显低于癌旁正常组织，miR-21 表达水平明显高于癌旁正常组织，二者表达的水平呈负相关，且各与食管癌临床分期、 肿瘤分化程度、淋巴结转移及患者的生存率密切相关，而与食管癌患者年龄、性别、 肿瘤部位无明显相关性。 Lin等［67］发现与邻近正常组织相比，EAC、ESCC均有明显的miR-421表达上调， 并且miR-421的表达上调与EAC更短的OS有关，对ESCC无相关的预测作用。 Yang等［68］的一项Meta分析发现miRNA-15a作为抑癌因子，其下调与膀胱癌、 头颈癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤较低的OS相关，但在EC表现为相反结果（HR＝0.53，95%CI 0.34～0.85；p＝0.0072）。 Hong等［69］通过TCGA（Cancer Genome Atlas）数据库研究发现miR-550a高表达 的 EC患者生存期较短，miR-550a的异常表达通过调节肌肉系统与肿瘤的复发有关。 Liu等［70］的研究发现外排体转导的 miR-93-5p通过靶向 PTEN的细胞内通信促进 ESCC细胞的增殖。实时定量聚合酶链反应（ RT-PCR）检查结果显示 miR-93-5p的表 达显著增加食管癌的风险且和不良预后相关，细胞转染共培养，荧光素酶报告试验和 western-blot试验发现外排体导入的 miR-93-5p可促进食管癌细胞的增殖，影响 PTEN 和下游蛋白 P21和 cyclin D1的表达。 Liu等［71］发现与邻近组织相比， miR-373在 ESCC癌组织中表达上调；在 ESCC 患者的血清中，其表达水平也高于正常志愿者。食管鳞癌细胞系 miR-373的过表达可 以促进细胞增殖，增加 G1期细胞的比例，增强癌细胞迁移和侵犯能力；另一方面，抑 制 miR-373d的表达可以减少增殖，减少 G1期细胞比例，抑制迁移及侵犯，诱导细胞 凋亡。他们的研究还发现 miR-373的直接靶点为 TIMP3，后者可以抑制食管鳞癌细胞 的侵犯和转移， miR-373和 TIMP3表达水平及功能均呈负相关。 miR-373d可作为食管 诊断的生物标志物和治疗的靶点。 在 Bus等［72］的研究中，研究人员收集 6例对照组、 8例 BE和 8例 EAC患者的 血浆，采用定量 PCR的方法进行表达谱分析；选择 6个 miRNAs，采用 RT-PCR的 方法在 115例正常对照、 BE和 EAC患者的血浆标本进行验证，发现 EAC患者有 3个 miRNA表达增加， BE患者有 4个 miRNA表达增加；验证试验发现 EAC患者 miRNA-382-5p表达显著增加，而 miRNA-133a-3p显著减少， BE患者 miRNA-1945p 和 miRNA-451a较对照组显著增加，而 miRNA-136-5p显著下降；联合 3个及以上 miRNA，诊断性能更佳。 BE/正常对照， AUC为 0.832；EAC/正常对照， AUC为 0.846；BE/EAC，AUC为 0.797。 miRNA簇在不同的器官广泛表达，大量研究表明 miRNA簇比单一 miRNA在肿瘤 的发生中作用更大。 miRNA簇可能是比单一 miRNA更稳定、可靠的诊断和治疗生物 标志物。 Gao等［73］对 miR-144/451簇的研究发现肿瘤组织的 hsa-miR-451a、hsa-miR144- 3p、hsa-miR-144-5p表达水平比癌旁组织显著降低。 miR-144/451簇成员的表达水 平除 hsa-miR-144-3p和 hsa-miR-4732-3p外，彼此相关。尤其 hsa-miR-144-5p的表达与 hsa-miR-4732-5p和 hsa-miR-451a高度相关，共表达率分别为 0.729和 0.608；hsa-miR144- 3p和 hsa-miR-144-5p的低表达是食管癌进展的确定危险因子，构成 miR-144/451 簇的 miRNAs可能共同参与细胞周期的调节。 （四）环状 RNA 环状 RNA（circle RNA，circRNA）通常被认为是 ncRNA，但越来越多的证据证实 了某些特定 circRNA具有编码蛋白质的能力。与传统的线性 RNA不同， circRNA的特 征是共价闭环结构，既没有 5′帽也没有 3′尾，并且不会被 RNA外切酶消化。近年来， 越来越多的研究表明，circRNA在细胞、组织和发育阶段的表达可能存在较大差异，其 功能可能包括：作为竞争性内源性 ncRNA或 miRNA海绵，与 RNA结合蛋白相互作 用，调控亲本基因的表达或者编码蛋白。已有乳腺癌、胃癌和结直肠癌中 circRNA调 第一章　.早期食管癌的预测013 控异常的报道，提示circRNA有可能成为新的肿瘤生物标志物。 Wang等［74］研究发现circRNAs 0043898在EC标本中表达下调；细胞系研究证实 circRNAs0043898过表达可以阻止肿瘤细胞增生、迁移和侵犯，并可诱导肿瘤细胞的凋 亡；活体动物实验亦提示circRNAs0043898具有肿瘤抑制作用，Histone H3和BMI1可 能是circRNAs0043898的作用靶点。总之，circRNAs0043898具有抑制肿瘤的作用，可 作为诊断的指标和治疗的靶点。 Song等［75］研究发现，在48例ESCC患者肿瘤组织中，hsa_circ_0000337表达 出现改变，细胞系研究发现hsa_circ_0000337在ESCC细胞系TE-1较食管鳞状上皮 细胞系表达增加，敲除hsa_circ_0000337可以显著减弱TE-1和KYSE-150两种ESCC 细胞系的增殖、迁移和侵犯能力；生物信息预测和双荧光素酶报告试验证明hsa_ circ_0000337可结合miR-670-5p（21种基因受miR-670-5p调节），在肿瘤的发生中发 挥作用。 Shi等［76］研究发现circ-PRKCI在5例ESCC组织和配对的邻近正常组织有相对表 达，RNA免疫共沉淀和荧光素酶试验证实miR-3680-3p、AKT3或circ-PRKCI有相互 直接作用，circ-PRKCI在SECC表达显著上调，进一步刺激细胞的迁移和增殖；机制 方面：circ-PRKCI作为miR-3680-3p的分子海绵可上调AKT的表达，即circ-PRKCI/ miR-3680-3p/AKT3在ESCC的发生中发挥重要作用。 四、基因表达谱分析 随着二代DNA测序技术和RNA测序（RNA-seq）技术的发展，生物信息分析方 法已成为近年来兴起的寻找肿瘤可能的致病基因的新方法，通过构建组织芯片，进行 数据库分析，找出得差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），挑选出差 异表达最显著的基因，进一步进行关联及功能分析，确定它们在疾病发生中可能的作 用，通过表达谱分析寻找食管癌新的生物标志物，及潜在的基因治疗靶点。 杨孝荣等［19］研究发现江苏省泰兴市的ESCC碱基替换类型以C＞T的转换为主 （接近50%），其次为T＞C的转换和C＞A的颠换。他发现了5个局部超突变基因座， 用MutSigCV算法鉴定出6个可能与食管鳞癌相关的显著突变驱动基因，即TP53、 PABPC1、FBXW4、ZNF814、CDKN2A和ANKRD20A1。另外，他还发现54个肿瘤 频发体细胞突变，主要位于ZNF717、ZNF814、FRG1、CLASRP、CTBP2、EVPL、 GXYLT1、IFITM3、NBPF16、OR4C5、POU6F2、SLC9B1P1、TEKT4、TPSAB1等 43个基因上。他初步构建了当地食管鳞癌的外显子区域基因组突变图谱。 Chen等［77］用生物信息分析的方法寻找食管鳞癌的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），收集了17个ESCC组织标本和13个邻近正常组织标本，从基 因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载构建表达芯片，总共发现了 22 277个DEGs，采用Morpheus在线工具制作热图，筛选出前100个上调基因和前100 个下调基因以进行进一步分析，包括：GO（基因本体，gene ontology）分类、KEGG 第一章　.早期食管癌的预测013 控异常的报道，提示circRNA有可能成为新的肿瘤生物标志物。 Wang等［74］研究发现circRNAs 0043898在EC标本中表达下调；细胞系研究证实 circRNAs0043898过表达可以阻止肿瘤细胞增生、迁移和侵犯，并可诱导肿瘤细胞的凋 亡；活体动物实验亦提示circRNAs0043898具有肿瘤抑制作用，Histone H3和BMI1可 能是circRNAs0043898的作用靶点。总之，circRNAs0043898具有抑制肿瘤的作用，可 作为诊断的指标和治疗的靶点。 Song等［75］研究发现，在48例ESCC患者肿瘤组织中，hsa_circ_0000337表达 出现改变，细胞系研究发现hsa_circ_0000337在ESCC细胞系TE-1较食管鳞状上皮 细胞系表达增加，敲除hsa_circ_0000337可以显著减弱TE-1和KYSE-150两种ESCC 细胞系的增殖、迁移和侵犯能力；生物信息预测和双荧光素酶报告试验证明hsa_ circ_0000337可结合miR-670-5p（21种基因受miR-670-5p调节），在肿瘤的发生中发 挥作用。 Shi等［76］研究发现circ-PRKCI在5例ESCC组织和配对的邻近正常组织有相对表 达，RNA免疫共沉淀和荧光素酶试验证实miR-3680-3p、AKT3或circ-PRKCI有相互 直接作用，circ-PRKCI在SECC表达显著上调，进一步刺激细胞的迁移和增殖；机制 方面：circ-PRKCI作为miR-3680-3p的分子海绵可上调AKT的表达，即circ-PRKCI/ miR-3680-3p/AKT3在ESCC的发生中发挥重要作用。 四、基因表达谱分析 随着二代DNA测序技术和RNA测序（RNA-seq）技术的发展，生物信息分析方 法已成为近年来兴起的寻找肿瘤可能的致病基因的新方法，通过构建组织芯片，进行 数据库分析，找出得差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），挑选出差 异表达最显著的基因，进一步进行关联及功能分析，确定它们在疾病发生中可能的作 用，通过表达谱分析寻找食管癌新的生物标志物，及潜在的基因治疗靶点。 杨孝荣等［19］研究发现江苏省泰兴市的ESCC碱基替换类型以C＞T的转换为主 （接近50%），其次为T＞C的转换和C＞A的颠换。他发现了5个局部超突变基因座， 用MutSigCV算法鉴定出6个可能与食管鳞癌相关的显著突变驱动基因，即TP53、 PABPC1、FBXW4、ZNF814、CDKN2A和ANKRD20A1。另外，他还发现54个肿瘤 频发体细胞突变，主要位于ZNF717、ZNF814、FRG1、CLASRP、CTBP2、EVPL、 GXYLT1、IFITM3、NBPF16、OR4C5、POU6F2、SLC9B1P1、TEKT4、TPSAB1等 43个基因上。他初步构建了当地食管鳞癌的外显子区域基因组突变图谱。 Chen等［77］用生物信息分析的方法寻找食管鳞癌的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），收集了17个ESCC组织标本和13个邻近正常组织标本，从基 因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载构建表达芯片，总共发现了 22 277个DEGs，采用Morpheus在线工具制作热图，筛选出前100个上调基因和前100 个下调基因以进行进一步分析，包括：GO（基因本体，gene ontology）分类、KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析、蛋白 -蛋白交互网络和 Spearman 关联分析。他们发现的前 10位枢纽蛋白为细胞周期依赖激酶 4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）、不受苯并咪唑抑制的出芽 1（budding uninhibited by benzimidazole 1）、细胞 周期蛋白 B2（Cyclin B2）、热休克蛋白（ hot shock protein，HSP）90AA1、光激酶 A（aurora kinase A）、H2A组蛋白家族 Z、复制因子 C亚单元 4（replication factor C subunit 4）和微染色体维持复合物组分（minichromosome maintenance complex component）2，-4 和 -7，并发现 SLURP-1，通过 RT-PCR方法发现 ESCC标本中 SLURP-1的表达明显低 于正常癌旁组织。这些结果表明，以上所述的枢纽蛋白和枢纽基因 SLURP-1可能是潜 在的治疗靶点，而基因功能障碍可能参与了 ESCC的肿瘤发生。 Wang等［78］也使用了生物信息学方法。他们收集了 5例 ESCC患者的肿瘤上皮和 邻近正常上皮，从 GEO数据库下载数据集，构建组织芯片，通过线性模型微阵列 R 数据包识别 DEGs，用 WGCNA（weighted correlation network analysis）构建共表达网 络，识别 487个上调和 468个下调的 DEGs，进一步进行 GO分析，最终发现泛素结 合酶 E2C（ubiquitinconjugating enzyme E2C，UBE2C）、细胞分化周期 20（cell division cycle 20，CDC20）、微染色体维持复合物组分 6（minichromosome maintenance complex component 6，MCM6）、转铁蛋白受体（ transferrin receptor，TFRC）、TEA结构域转录 因子 4（TEA domain transcription factor 4，TEAD4）、蛋白磷酸化酶 1调节亚单位 3C（protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C）、MAL和 T细胞分化蛋白这些 DEGs可能 在 ESCC的发生中发挥作用。 原发性小细胞食管癌（ primary small cell esophageal carcinoma，SCEC）是食管鳞 状上皮来源的较为罕见、进展凶险的恶性肿瘤，其临床表现、病理及形态学与小细胞 肺癌（ small cell lung cancer，SCLC）类似。 Liu等［79］采用表达谱分析拷贝数相关的 基因表达突变（copy number variations-associated gene expression aberration，CNV-FC）， 发现 SCEC患者的 WNT基因通路表达显著上调，而 PTEN和 notch基因通路显著下 调，PTP4A3过表达，它们可作为分子标记及治疗靶点。 何思源等［80］在肿瘤基因图谱（ the cancer genome atlas，TCGA）数据库中检索了 81例食管鳞癌患者的转录组数据和临床资料，共鉴定出 2788个 DEGs，其中 1168个 基因在肿瘤组织中的表达水平上调， 1620个基因在肿瘤组织中的表达水平下调。上 调的基因富集到细胞周期、 DNA复制和错配修复等通路，下调的基因富集到代谢 相关通路。核糖体蛋白基因与肿瘤所在的食管部位有关， TNFRSF10B高表达组和 TNFRSF10B低表达组患者的 3年生存率分别为 82.5%和 15.1%，DDX18高表达组和 DDX18低表达组患者的 3年生存率分别为 82.4%和 15.2%，TNFRSF10B和 DDX18的 低表达与患者的预后差有关，它们是食管鳞癌患者预后的潜在生物标志物。 五、基因多态性 张立玮［8］探讨了 IL-8基因多态性与食管癌、贲门癌发病风险之间的关系。他发现 第一章　.早期食管癌的预测015 携带IL-8-251AA基因型的个体贲门癌发病风险显著增加，食管癌患者发病风险与IL8- 251位点单核苷酸多态无相关性；吸烟是食管癌发生的危险因素，尚未发现IL-8各 基因型与吸烟状况存在交互作用。 陈梦如［15］在食管癌高发区江苏省扬中市的病例对照研究中，采用PCR-RFLP的 分子生物学技术分析XPD Lys751Gin、XRCC1Arg399Gln、P5372密码子Arg/Pro和 MDM2 SNP309 T/G的基因多态在ESCC发生中的作用及其与环境因素之间基于相乘模 型的交互效应，发现DNA损伤修复基因XPDLys751Gln与扬中市男性居民ESCC遗传 易感性有关；XRCC1 Arg399Gln与扬中市女性居民食管癌遗传易感性有关。P5372外 显子Arg/Pro和MDM2 SNP 309 T/G的基因多态与ESCC遗传易感性有关。MDM2的 蛋白表达与肿瘤分期有关，Ⅱ期患者的表达率最高。 杨艳芳等［4］研究发现MTHFR677位点C/T和T/T基因型与ESCC发生无关，与 食管黏膜异型增生和基底细胞增生有关，在其发生中起保护作用；这两种基因型可降 低吸烟者或饮酒者发生异型增生的危险性；未见CYP2E1基因多态性和hOGG1基因多 态性与食管癌衍变不同阶段病变有关联；外周血中SCCA2 mRNA表达与ESCC衍变阶 段有关，hTERT和EYA4 mRNA表达与ESCC衍变阶段无关，结果提示外周血SCCA2 mRNA表达水平的变化有望用于食管癌癌前病变的动态监测。 在乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）基因多态性与ESCC癌前 不同疾病的关联研究中，周英智［6］发现ALDH2 G/G型与癌前异型增生、基底细胞增 生有关联；血清促血管生成素2（angiopoietin 2，Ang2）水平与食管黏膜上皮癌前病变 程度有一定关联，可能对高危个体长期监测有一定意义。 Fang等［81］研究探讨了白细胞端粒酶长度相关酶ACYP2多态性与ESCC之间的 关系。基因组研究证明白细胞端粒酶长度与ACYP2相关，ACYP2多态性影响中国汉 族人群EC的发病风险。rs11125529 C等位基因ESCC风险比rs11125529 C等位基因 的高；rs11896604和rs17045754位点也增加ESCC的风险；单核苷酸多态性（SNPs） rs1682111、rs843752、rs10439478、rs843645、rs11125529、rs843711、rs1189660allele及 “TTCTATG”重复序列也是EC风险增加的标志。 六、代谢组学 1999年，Nicholson教授首次提出代谢组学概念［82］。肿瘤组织的代谢状况与正 常组织明显不同。机体的代谢产物主要存在于各种体液（包括血液、尿液、唾液、精 液和脑脊液等）中，采集此类样本并用质谱（mass spectrometry，MS）、核磁共振谱 （nuclear magnetic resonance spectrometry，NMR）等高通量检测及化学分析技术分析， 尽早发现异常的代谢标志物，为恶性肿瘤的早期诊断和治疗做贡献。 2012年，Davis等［83］研究发现，对比EAC患者、BE患者和正常对照组的尿液标 本，呈现明确的离散信号，可以把BE、EAC和正常对照组清晰地区分开；EAC患者 的代谢谱与其癌前病变BE也呈离散型；在肿瘤特异性检测中，EAC的代谢谱与胰腺 第一章　.早期食管癌的预测015 携带IL-8-251AA基因型的个体贲门癌发病风险显著增加，食管癌患者发病风险与IL8- 251位点单核苷酸多态无相关性；吸烟是食管癌发生的危险因素，尚未发现IL-8各 基因型与吸烟状况存在交互作用。 陈梦如［15］在食管癌高发区江苏省扬中市的病例对照研究中，采用PCR-RFLP的 分子生物学技术分析XPD Lys751Gin、XRCC1Arg399Gln、P5372密码子Arg/Pro和 MDM2 SNP309 T/G的基因多态在ESCC发生中的作用及其与环境因素之间基于相乘模 型的交互效应，发现DNA损伤修复基因XPDLys751Gln与扬中市男性居民ESCC遗传 易感性有关；XRCC1 Arg399Gln与扬中市女性居民食管癌遗传易感性有关。P5372外 显子Arg/Pro和MDM2 SNP 309 T/G的基因多态与ESCC遗传易感性有关。MDM2的 蛋白表达与肿瘤分期有关，Ⅱ期患者的表达率最高。 杨艳芳等［4］研究发现MTHFR677位点C/T和T/T基因型与ESCC发生无关，与 食管黏膜异型增生和基底细胞增生有关，在其发生中起保护作用；这两种基因型可降 低吸烟者或饮酒者发生异型增生的危险性；未见CYP2E1基因多态性和hOGG1基因多 态性与食管癌衍变不同阶段病变有关联；外周血中SCCA2 mRNA表达与ESCC衍变阶 段有关，hTERT和EYA4 mRNA表达与ESCC衍变阶段无关，结果提示外周血SCCA2 mRNA表达水平的变化有望用于食管癌癌前病变的动态监测。 在乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）基因多态性与ESCC癌前 不同疾病的关联研究中，周英智［6］发现ALDH2 G/G型与癌前异型增生、基底细胞增 生有关联；血清促血管生成素2（angiopoietin 2，Ang2）水平与食管黏膜上皮癌前病变 程度有一定关联，可能对高危个体长期监测有一定意义。 Fang等［81］研究探讨了白细胞端粒酶长度相关酶ACYP2多态性与ESCC之间的 关系。基因组研究证明白细胞端粒酶长度与ACYP2相关，ACYP2多态性影响中国汉 族人群EC的发病风险。rs11125529 C等位基因ESCC风险比rs11125529 C等位基因 的高；rs11896604和rs17045754位点也增加ESCC的风险；单核苷酸多态性（SNPs） rs1682111、rs843752、rs10439478、rs843645、rs11125529、rs843711、rs1189660allele及 “TTCTATG”重复序列也是EC风险增加的标志。 六、代谢组学 1999年，Nicholson教授首次提出代谢组学概念［82］。肿瘤组织的代谢状况与正 常组织明显不同。机体的代谢产物主要存在于各种体液（包括血液、尿液、唾液、精 液和脑脊液等）中，采集此类样本并用质谱（mass spectrometry，MS）、核磁共振谱 （nuclear magnetic resonance spectrometry，NMR）等高通量检测及化学分析技术分析， 尽早发现异常的代谢标志物，为恶性肿瘤的早期诊断和治疗做贡献。 2012年，Davis等［83］研究发现，对比EAC患者、BE患者和正常对照组的尿液标 本，呈现明确的离散信号，可以把BE、EAC和正常对照组清晰地区分开；EAC患者 的代谢谱与其癌前病变BE也呈离散型；在肿瘤特异性检测中，EAC的代谢谱与胰腺 癌的代谢谱也清晰可分；这些研究提示尿液代谢组学可以用于 EAC及 BE的初步筛查。 张海平等［84］利用液相色谱 -质谱联用技术（ LC-MS）对哈萨克族食管鳞癌患者， 与正常哈萨克族人群的血清和组织样本进行代谢组学分析。血清代谢组学研究筛选出 焦谷氨酸、乳酸、丙酮醛、谷氨酸、天冬氨酸、胆碱和牛磺酸 7个代谢物作为早期食 管癌的相关生物标志物；组织代谢组学研究筛选出谷氨酸、油酸、溶血性磷脂酰胆碱、 尿嘧啶、次黄嘌呤核苷、胆碱、谷氨酰胺、犬尿氨酸、丝氨酸 9个代谢物为食管癌相 关的生物标志物；结合以前的尿液代谢组学研究结果发现谷氨酰胺代谢增强是早期食 管鳞癌显著的代谢特征之一；免疫组化方法进一步证实谷氨酰胺酶 1（GLS1，谷氨酰 胺代谢的关键酶）和溶质载体家族 1成员 5（SLC1A5，谷氨酰胺进入细胞的转运体） 在食管癌组织的表达增加，可为未来早期食管鳞癌的筛查和个体化靶向治疗提供新的 思路和方向。 2013年，Zhang等［85］对 25例 ESCC患者和 25例正常人的血浆样本进行代谢组学 分析，发现 ESCC患者的乙酰乙酸盐、羟基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸盐水平较 正常明显升高；而 ESCC患者的低 /极低密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、蛋氨酸、葡萄糖 较正常人显著降低。 2014年，Ma等［86］针对不同分期的食管癌患者，即 51例哈萨克族 ESCC患者（食 管癌患者包括中低分化癌 24例、淋巴结转移 17例，其中临床分期大于Ⅰ b2期的 36 例）与 60例健康对照组的血浆进行代谢组学分析。在食管癌患者中，绝大多数氨基酸 代谢水平呈下降趋势，谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、牛磺酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、缬氨酸等的代谢水平与食管癌的分期密切相关。 2013年，Yang等［87］用高分辨率旋转（ high-resolution magic-angle spinning， HRMAS）NMR分析未受侵犯的肿瘤邻近组织、分化良好及中分化的食管癌肿瘤组织， 发现与未侵犯邻近组织相比，中分化食管鳞癌的总胆碱、丙氨酸、谷氨酸增加而肌酸、 肌醇和牛磺酸减少；肿瘤分化程度不同，代谢谱也存在差异；不同组织的整体甘氨酸 / 肌醇比不同，以此可以区分未侵犯组织、高分化及中分化食管癌组织。 2010年，杨永霞等［88］对健康人（ 10例）和 EC患者（ 20例）血清样本进行核磁 共振氢谱（ 1H nuclear magnetic resonance， 1H NMR）分析，发现 EC患者血清中脂类、 乳酸和丙酮酸的含量升高，葡萄糖、三甲胺和胆碱 /磷酸胆碱的含量降低。 2012年，于连珍等［89］基于 LC-MS等技术研究发现 EC患者糖酵解代谢活跃，三 羧酸循环代谢受阻。 EC患者组织中大部分氨基酸、游离脂肪酸水平高于癌旁组织， 而在血清中低于对照组，这些在血清中有规律变化的化合物是食管癌潜在的生物标 志物。 Abbassi-Ghadi等［90］2013年对已有的食管癌、胃癌代谢组学研究进行总结，其中 关于组织标本的研究有 11个，关于血清标本的研究有 8个，关于尿液的研究有 1个， 关于胃内容物的研究有 1个，他发现糖酵解、三羧酸循环、厌氧呼吸和蛋白质、脂类 代谢的几种代谢产物存在显著差异。乳酸盐和富马酸盐是与细胞呼吸有关的食管癌、 胃癌最常见的生物标志物。缬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸是最常见的氨基酸生物标志 第一章　.早期食管癌的预测017 物；脂质代谢产物包括饱和、不饱和的游离脂肪酸，酮、醛和三酰甘油也被确认为食 管-胃癌的生物标志物。 Mir等［91］在2015年发表的研究论文中，采用液相色谱-质谱（LS-MS）联用的方 法，发现ESCC患者存在磷脂酰胆碱代谢紊乱，它可作为ESCC的生物标志物。 2015年，Sanchez-Espiridion等［92］检测了30例病理确诊的EAC患者和30例健康 对照组的血清标本，发现64个代谢产物存在显著差异；差异最大的氨基酸类代谢物为 L-脯氨酸（LP）；酮体类为3-羟基丁酸酯（BHBA）；碳水化合物类代谢产物为D-甘 露糖（DM）；这些差异在321例EAC和331例对照组的验证实验中得到证实：EAC 患者的LP浓度显著低于对照组；EAC患者的BHBA、DM浓度显著高于对照组；三者 的危险程度均呈浓度依赖关系，且与吸烟和体重指数呈加成关系。 2016年，Wang等［93］对97例ESCC患者和105例健康对照组的血清进行代谢组 学分析，发现16个确定代谢物的代谢途径受到干扰，较具特征的是脂肪酸生物合成、 甘油磷脂代谢、癌症胆碱代谢和亚油酸代谢失调。这些代谢失常在早期ESCC诊断中 效力良好，0期、Ⅰ、Ⅱ期ESCC的AUC值均为0.881。6种代谢产物有助于ESCC分 期的确立，其中十二烷酸、溶菌酶（18∶1）、溶菌酶（14∶0）三种生物标志物升高， 提示ESCC病情有明显的进展趋势。 Buas等［94］在2017年发表的研究论文中，用LC-MS方法分析了322个GERD、 BE、HGD、EAC患者的57种代谢产物，发现BE与GERD，GHD、EAC与BE，有 多种代谢物存在显著差异；几个顶级候选代谢物，包括尿酸盐、同型半胱氨酸和3-硝 基酪氨酸，与炎症过程有关，可能参与BE、EAC的致病过程；GERD与BE个体之间， 以及BE与HGD、EAC个体之间，也存在血清代谢物差别。 2017年，李江硕等［95］采用高效液相色谱-高分辨串联质谱技术（LC-HRMS）分 别对142例ESCC患者和150例健康志愿者的血浆进行非靶向代谢组学研究，鉴定出 45个差异代谢物，即潜在生物标志物。对潜在标志物进行生物学意义分析，发现食管 鳞癌患者体内甘油磷脂代谢、脂肪酸β-氧化、酪氨酸和苯丙氨酸代谢等多条代谢通路 发生紊乱。其中，由酪氨酸、苯丙氨酸、油酸、棕榈酸等17个差异代谢物组成的标志 物组具有良好的诊断能力，ROC曲线下面积达0.996，有望用于临床诊断。 Yang等［96］在2019年发表的研究论文中，用核磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）鉴定出6个早期的血清代谢产物——α-葡萄糖、 胆碱、谷氨酸盐、谷氨酸、缬氨酸和二氢胸腺嘧啶，它们可作为ESCC潜在的诊断生 物标志物。 Liang等［97］在2019年发表的研究论文中，收集了41例EC患者标本、40例健 康对照组的尿液标本，以及20例肿瘤组织标本和正常的癌旁组织标本，他发现组织 和尿液标本的代谢产物变化存在重叠，包括葡萄糖、甘氨酸、肌酐和牛磺酸水平降 低，同时伴随谷氨酸和柠檬酸水平升高，且大多数尿液代谢产物（除谷氨酸、柠檬酸 和葡萄糖外）的变化与EC组织中的代谢产物变化相关（除甘氨酸和乙酸盐外）；由 乙酰乙酸、顺乌头酸、马尿酸、乙醇胺、甘氨酸、肌酐和牛磺酸组成的尿代谢物标志 第一章　.早期食管癌的预测017 物；脂质代谢产物包括饱和、不饱和的游离脂肪酸，酮、醛和三酰甘油也被确认为食 管-胃癌的生物标志物。 Mir等［91］在2015年发表的研究论文中，采用液相色谱-质谱（LS-MS）联用的方 法，发现ESCC患者存在磷脂酰胆碱代谢紊乱，它可作为ESCC的生物标志物。 2015年，Sanchez-Espiridion等［92］检测了30例病理确诊的EAC患者和30例健康 对照组的血清标本，发现64个代谢产物存在显著差异；差异最大的氨基酸类代谢物为 L-脯氨酸（LP）；酮体类为3-羟基丁酸酯（BHBA）；碳水化合物类代谢产物为D-甘 露糖（DM）；这些差异在321例EAC和331例对照组的验证实验中得到证实：EAC 患者的LP浓度显著低于对照组；EAC患者的BHBA、DM浓度显著高于对照组；三者 的危险程度均呈浓度依赖关系，且与吸烟和体重指数呈加成关系。 2016年，Wang等［93］对97例ESCC患者和105例健康对照组的血清进行代谢组 学分析，发现16个确定代谢物的代谢途径受到干扰，较具特征的是脂肪酸生物合成、 甘油磷脂代谢、癌症胆碱代谢和亚油酸代谢失调。这些代谢失常在早期ESCC诊断中 效力良好，0期、Ⅰ、Ⅱ期ESCC的AUC值均为0.881。6种代谢产物有助于ESCC分 期的确立，其中十二烷酸、溶菌酶（18∶1）、溶菌酶（14∶0）三种生物标志物升高， 提示ESCC病情有明显的进展趋势。 Buas等［94］在2017年发表的研究论文中，用LC-MS方法分析了322个GERD、 BE、HGD、EAC患者的57种代谢产物，发现BE与GERD，GHD、EAC与BE，有 多种代谢物存在显著差异；几个顶级候选代谢物，包括尿酸盐、同型半胱氨酸和3-硝 基酪氨酸，与炎症过程有关，可能参与BE、EAC的致病过程；GERD与BE个体之间， 以及BE与HGD、EAC个体之间，也存在血清代谢物差别。 2017年，李江硕等［95］采用高效液相色谱-高分辨串联质谱技术（LC-HRMS）分 别对142例ESCC患者和150例健康志愿者的血浆进行非靶向代谢组学研究，鉴定出 45个差异代谢物，即潜在生物标志物。对潜在标志物进行生物学意义分析，发现食管 鳞癌患者体内甘油磷脂代谢、脂肪酸β-氧化、酪氨酸和苯丙氨酸代谢等多条代谢通路 发生紊乱。其中，由酪氨酸、苯丙氨酸、油酸、棕榈酸等17个差异代谢物组成的标志 物组具有良好的诊断能力，ROC曲线下面积达0.996，有望用于临床诊断。 Yang等［96］在2019年发表的研究论文中，用核磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）鉴定出6个早期的血清代谢产物——α-葡萄糖、 胆碱、谷氨酸盐、谷氨酸、缬氨酸和二氢胸腺嘧啶，它们可作为ESCC潜在的诊断生 物标志物。 Liang等［97］在2019年发表的研究论文中，收集了41例EC患者标本、40例健 康对照组的尿液标本，以及20例肿瘤组织标本和正常的癌旁组织标本，他发现组织 和尿液标本的代谢产物变化存在重叠，包括葡萄糖、甘氨酸、肌酐和牛磺酸水平降 低，同时伴随谷氨酸和柠檬酸水平升高，且大多数尿液代谢产物（除谷氨酸、柠檬酸 和葡萄糖外）的变化与EC组织中的代谢产物变化相关（除甘氨酸和乙酸盐外）；由 乙酰乙酸、顺乌头酸、马尿酸、乙醇胺、甘氨酸、肌酐和牛磺酸组成的尿代谢物标志 物较单一产物诊断 EC的效力更强（敏感性、特异性、 AUC分别为 92.68%、92.50% 和 0.971）。 总体说来，食管癌的代谢组学特点符合一般恶性肿瘤的特点，在氨基酸代谢中， 表现为蛋白质合成增加，同时谷氨酰胺因大量消耗而浓度明显降低。在糖代谢方面， 即使在氧气充足的条件下，恶性肿瘤糖酵解同样活跃，因而食管癌患者血浆中乳酸大 量堆积，当机体不能将乳酸完全还原成葡萄糖时，乙酰辅酶 A堆积，柠檬酸盐增加； 假如血浆中没有乙酰辅酶 A累积，那么糖代谢可能被生酮作用代替。在脂肪代谢方面， 肿瘤细胞生长快，增殖迅速，为了满足细胞增殖的能量及细胞膜构建需求，磷脂酰胆 碱代谢出现紊乱。代谢组学标本容易获取，多为无创性的，且能反映肿瘤生物学行为， 作为肿瘤的生物标志物具有良好的应用前景，目前代谢组学研究结果均一性欠佳，且 不能体现器官及组织的特异性，仍须更多的试验研究，以取得较一致的结果。 七、蛋白组学 采用质谱分析等高通量平台技术，寻找并鉴定肿瘤组织与正常组织的差异表达蛋 白及其功能，这是目前肿瘤蛋白组学的主要内容。 张立玮［8］用 SELDI-TOF-MS（表面增强激光解吸电离飞行时间质谱）技术检测食 管癌癌、贲门癌及癌前病变患者的血清蛋白质谱变化，结合支持向量机算法，共建立 了 15个蛋白指纹图谱模型，其中 10个模型的灵敏性和特异性都高；进一步对比分析 发现，重复出现的 5个质荷比峰（ m/z值为 4291、4975、5644、5664、8775）对食管 病变有相似的分类作用。 李晓静等［98］用同位素标记相对和绝对定量法（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）联合基质辅助激光解吸离子化串联飞行时间质谱（ MALDITOF/ TOF MS）分析，发现 52种蛋白质的表达随生存期延长而上调，载脂蛋白 D（ApoD）是其中之一，免疫组织化学研究结果显示 ApoD在正常食管鳞状上皮中表达 最高，在生存期 ≥5年组中表达其次，在生存期 ≤3年组中表达最低。 ApoD表达水平 与食管癌患者的生存期呈正相关，它可能成为预测食管癌患者预后情况的一种生物标 志物。 赵云岗等［99］采用 iTRAQ和串联质谱技术鉴定 244个 ESCC相关的差异表达蛋 白质，通过生物信息检索及蛋白质与蛋白质相互作用网络（ protein-protein interaction network，PPIN），分析确定了 4个蛋白质： FN1、ITGB1、TAGLN、YWHAZ，它们 可能是参与食管癌变的关键蛋白质， Western-blot实验证实 FN1、ITGB1、TAGLN和 YWHAZ 4个关键蛋白质在 ESCC中存在显著的表达差异。 外体（ exosome）是指直径为 30～150 nm的由细胞分泌的盘状囊泡，其中包含了 多种复杂的 RNA以及蛋白质。它不仅参与细胞间的通信和迁移，而且与肿瘤细胞的生 长也有密切的关系。在肿瘤中，细胞会通过分泌外体来改变周围环境，而且肿瘤细胞 还会通过将特异性抗原附着在其表面形成扩散作用。张浩亮等［100］通过蛋白组学技术 第一章早期食管癌的预测 019 　. 分离 46例 ESCC患者与 46例健康对照组的血浆外排体蛋白质，用 PPIN和生物信息方 法筛选出 8种有效的差异蛋白——免疫球蛋白的 α2链 C区、α-2-HS-糖蛋白（AHSG）、 CD9抗原、富含亮氨酸的 α2糖蛋白、触珠蛋白、 CD63抗原和 S100A9蛋白、血清白 蛋白；其中， AHSG和 S100A9表达水平升高，有可能成为诊断早期 ESCC的生物标 志物。 赵佳等［101］收集了 53例 ESCC患者和 53例健康对照组的血浆标本，借助双向荧 光差异凝胶电泳（ 2D-DIGE）、MALDI-TOF/TOF质谱分析等蛋白质组学技术进行分 析，发现与正常对照组相比， ESCC患者血浆表达上调的蛋白为 α1-抗胰凝乳蛋白酶、 AHSG、富含亮氨酸的 α2糖蛋白（ LRG）、锌 -α2-糖蛋白、补体因子Ⅰ、补体 C4B； 表达下调的蛋白为人血清白蛋白、免疫球蛋白的 α2链 C区、α-1抗胰蛋白酶、纤维 蛋白原 γ链、触珠蛋白、血红蛋白 α亚基。差异蛋白的 GO功能聚类大致分为以下 4 类：炎症反应、免疫反应、转运蛋白和凝血等生理功能相关的蛋白质。利用 String数 据库做蛋白相互作用预测，发现除 IGHA2、SERPINA3和 C4B外，其他 9种蛋白质有 可能存在直接或者间接的相互作用； Western blot实验结果表明， ESCC患者血浆中的 AHSG和 LRG浓度显著升高。 张艳等［102］采用激光捕获显微切割技术获取哈萨克族、汉族食管鳞癌细胞和癌旁 远端食管正常上皮细胞，鉴定出 43个差异蛋白质，在哈萨克族和汉族的 ESCC组织 表达均上调的蛋白质中，筛选出 4个表达上调的蛋白质（ Bmi-1、PAI-1、Cofilin-1、 Transgelin），并通过 western-blot和免疫组化实验验证，与临床病历特征结合分析，推 测这 4个蛋白质可能与 ESCC的分化程度、浸润、淋巴转移有关。 王雪芬等［103］用 iTRAQ方法检测得到 431个食管癌与癌旁组织差异蛋白，共同上 调蛋白和共同下调蛋白数量分别为 72和 57；体外培养细胞株发现 Wnt经典信号通路 的 Wnt2在食管鳞状细胞癌株中高表达； GSK3β在正常食管上皮细胞株中表达高于食 管鳞状细胞癌株；推测在 Wnt经典信号通路中， Wnt2与 GSK3β均参与了 ESCC的发 生与发展过程。 Yazdian-Robati等［104］比较了 ESCC患者肿瘤组织和癌旁正常组织的蛋白质差异 表达情况，筛选出 4个差异表达蛋白质—— ANX A1、PRDX2、转凝蛋白和肌动蛋白 2（ACTA2），并认为 ACTA2可能是 ESCC患者的潜在生物标志物。 生物功能的实现需要依靠蛋白质，蛋白质序列及作用数据库的建立将蛋白组学带 入新时代。差异表达蛋白质筛查与功能鉴定，使确定肿瘤发生过程中蛋白质数量、质 量的改变以及病理阶段的关键蛋白筛查成为可能。 第四节　小　　结 食管癌发病率高，早期诊断率低是目前食管癌流行病学的基本特征。 ESCC和 EAC为两种完全不同的疾病类型，其中 ESCC是我国最主要的食管癌类型，与遗传、 性别、年龄、饮食习惯、营养因素、吸烟等因素有关， EAC与胃食管反流、肥胖及吸 烟有关；避免不良的生活方式，接受规范的内镜筛查和定向活检是减少食管癌发病率、 早期发现、早期治疗，减少食管癌病死率，提高人们生活质量的关键。 食管癌传统的肿瘤标志物包括癌胚抗原（ CEA）、糖蛋白 50（CA50）、糖蛋 白 242（CA242）、糖蛋白 199（CA199）、组织多肽糖原（ TPA）、细胞角质蛋白 （Cyfra21-1）和神经特异性烯醇化酶（ NSE）及甲胎蛋白（ AFP）等。这些标志物诊 断缺乏特异性，对预后没有明显的预测意义。因此，我们需要更好的肿瘤分子标记。 随着人类基因组计划的完成及 RNA测序、质谱分析、核磁共振谱等技术的成熟，出 现了很多诊断效力更强的生物标志物，可能是一段 DNA、蛋白质、小分子代谢产物， 也有可能是转录调节因子或中间产物，它们不仅是食管癌的早期诊断与预后的预测分 子，还可作为分子治疗的靶点，但它们大都处于实验室阶段，需要更大样本的临床试 验验证。 参考文献 ［1］国家消化内镜专业质控中心, 国家消化系统疾病临床医学研究中心 (上海), 国家消化道早癌防治 中心联盟, 等. 中国早期食管癌及癌前病变筛查专家共识意见 (2019年, 新乡) [J]. 中华消化内镜 杂志, 2019, 36 (11): 793-801. ［2］ FREDDIE, BRAY, JACQUES, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. [J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2018, 68 (6): 394-424. ［3］李琮宇. 河南食管癌高发区食管癌家系收集和遗传流行病学分析 [D]. 郑州: 郑州大学, 2007. ［4］杨艳芳. 肥城市食管鳞癌衍变阶段的危险因素及生物标志物研究 [D]. 济南: 山东大学, 2008. ［5］侯钱英. 肥城市 2014—2017年居民死因分析 [D]. 济南: 山东大学, 2018. ［6］周英智. 肥城市食管鳞癌不同衍变阶段的影响因素研究 [D]. 济南: 山东大学, 2007. ［7］葛均波, 徐永健, 王辰. 内科学 [M]. 9版. 北京: 人民卫生出版社, 2018. ［8］张立玮. 高发区人群食管、贲门癌早诊早治研究 [D]. 石家庄: 河北医科大学, 2007. ［9］邹文娣. 高发区食管贲门癌内镜筛查及癌前病变自然史队列研究 [D]. 石家庄: 河北医科大学, 2011. ［10］王洋 . 山东省肥城农村食管癌筛查及居民认知现况和早诊早治意愿调查研究 [D]. 大连: 大连医 科大学, 2009. ［11］甄玉洁 . 叶酸代谢相关基因甲基化与哈萨克族食管癌及预后关系的研究 [D]. 乌鲁木齐: 新疆医 科大学, 2017. ［12］洛黛 (ADAMA KOROMA). 中国江苏淮安食管癌高发区食管癌前病变相关影响因素的流行病学 调查研究 [D]. 南京: 东南大学, 2018 ［13］刘亚洲 , 娄培安, 董宗美, 等. 2014—2016年徐州市城市癌症早诊早治筛查分析 [J]. 江苏预防医 学, 2018, 29 (4): 382-385, 388.