第3章酶促反应动力学
酶动力学是研究酶促反应的速度问题，即研究各种因素对酶促反应速度的影响。酶动力学理论与实验在生物化学领域，特别在酶学和酶工程研究和应用中，有十分重要的作用。例如，根据某些因素对酶促反应速度的影响，可推断该酶促反应的机制。又例如，要准确测定酶活力单位，就需要对最佳反应条件及各种因素的影响进行研究。
3.1单底物酶促反应动力学
酶促反应有单底物反应和多底物反应之分。单底物酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。先介绍单底物酶促反应动力学，而多底物酶促反应动力学放在后面阐述。
3.1.1米氏方程的推导
根据酶催化的中间产物学说，可得到式(31)：  

E+Sk1k-1ESk2E+P(31)

式中： E表示酶； S表示底物； ES表示酶底复合物； P表示产物，k1
、k-1
、k2
分别表示各反应速度常数。
3.1.1.1快速平衡假设对速度方程的推导
该假设如下： E+SES是一个快速平衡反应，即k2
相对k-1
来说很小，也即ES分解成产物的反应对这个平衡反应干扰很小，ESE+P
这步反应是式(31)总反应的限速反应。
依据上述假设可推导出速度方程： 
1) 在反应达平衡时，正反应速度vf=
逆反应速度vr
。
因为vf=k1 ［E］ ［S］, vr=k-1 ［ES］r，
所以k1［E］ ［S］=k-1［ES］，
k1(［Et］-［ES］)［S］=k-1［ES］ (［Et］ 表示总酶浓度)，
(［Et］-［ES］)［S］［ES］=k-1k1=KS(KS表示ES的解离常数)，
［ES］=［Et］［S］KS+［S］。

2) 由于v=k2［ES］［v表示式（31）反应的速度］，
所以v=k2［Et］［S］KS+［S］。
3) 由于vmax=k2［Et］(vmax表示最大反应速度)，

所以v=vmax［S］KS+［S］(32)



式(32)是由Michaelis和Menten根据以上假设推导出来的，所以简称米氏方程。从式(32)可以看出： 
当［S］KS
时，v≈vmax［S］［S］=vmax
，即［S］很大时，反应速度达最大值。这与实验结果相符。
当［S］KS
时，则v≈vmax［S］KS
。对某一反应来说，当酶浓度不变时，vmax
和KS
都是常数，所以v与［S］成正比关系。
米氏方程中的KS
为ES的解离常数。最初人们为了纪念米孟二氏，用Km来代替KS
，称米氏常数(Michaelis constant)。而1Km
称为酶与底物结合的亲和常数。
3.1.1.2稳态处理法对速度方程的推导
Briggs和Haldane考虑到许多酶的催化常数很高，即ESk2
E+P不能忽略，而且他们又发现很多酶的k2
k-1
。因此，提出了稳态假说来代替米氏的快速平衡假说。该假说指出： ［ES］不一定与［E］和［S］呈平衡。而是在反应进行很短时间后，［ES］即由零增加到一定值。此时尽管ES也在不断分解和生成，但其生成和分解速度相等，即其浓度达到了稳态，不再改变。用稳态处理推导速度方程过程如下： 
1) 由于在初速度条件下［P］很小，所以逆反应E+P
ES可以忽略不计。
2) 根据式(31),
因为ES生成速度=k1［E］［S］=k1(［Et］-［ES］)［S］
ES分解速度=k-1［ES］+k2［ES］=(k-1+k2)［ES］
所以k1(［Et］-［ES］)［S］=(k-1+k2)［ES］
得： ［ES］=k1［Et］［S］k1［S］+k-1+k2=［Et］［S］k-1+k2k1+［S］
3) 由于v=k2［ES］，vmax=k2［Et］
所以v=k2［Et］［S］k-1+k2k1+［S］=vmax［S］k-1+k2k1+［S］
用Km来代表k-1+k2k1，则得： 

v=vmax［S］Km+［S］(33)




图31酶促反应过程中［S］、［P］、［E］、

［ES］等随时间而改变的曲线

式(33)和式(32)形式几乎一样，只是式(33)中的Km=k-1+k2k1
，而式(32)中的KS=k-1k1
。当k2k-1
时，则Km≈KS。所以式(33)是更有普遍意义的方程，而式(32)只是稳态方程中的一种特殊情况。
图31是一个酶促反应的进程曲线，这是起始底物浓度［St］明显远大于起始酶浓度［Et］而得到的酶促反应进程曲线。随［St］/［Et］
比例增大，d［ES］dt=0
以前的时间将减少，而d［ES］dt=0
的反应时间范围将延长，即稳态假说更正确。
3.1.2米氏方程的讨论
3.1.2.1米氏方程的特性

米氏方程v=vmax［S］Km+［S］
属axb+x
形式的等轴双曲线方程，即酶促反应速度v
与［S］之间的关系为一双曲线。该双曲线的两条渐近线为v=vmax
，［S］=-Km，如图32所示。图中实验测得的部分，是双曲线中的实线部分，它是根据表31所列的v和S数据做出的，
从表31和图32都可看出： 当［S］浓度很大时，v=vmax
，双曲线趋于v=vmax
渐近线。当反应速度达最大反应速度的一半时，［S］=Km
,所以，Km
定义为反应速度达0.5vmax
时的底物浓度，其单位为浓度单位。



表31实验测得的v和［S］



［S］v
1000Km0.999vmax
100Km0.99vmax
10Km0.9vmax
3Km0.75vmax
1Km0.50vmax
0.33Km0.25vmax
0.10Km0.09vmax
0.01Km0.01vmax



图32米氏方程反应速度对底物浓度作图


3.1.2.2米氏方程中v与［S］的关系
当v=vmax
时，v与［S］无关，只和［Et］成正比，这时表明酶的活性部分已全部被底物占据。当v=0.5vmax
时，表示活性部位有一半被占据。当一个酶的Km已知，则任何底物浓度下酶活性部位被占据的分数
s=v/vmax=［S］Km+［S］
。s
又称为该酶促反应的相对速度。
米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和vmax的变化而变化，所以任何酶只要服从米氏方程，则到达任何两个vmax分数的对应底物浓度之比为一常数。例如，0.9vmaxvmax=［S］0.9Km+［S］0.9，所以［S］0.9=9Km
，同理［S］0.1=19Km
。所以，［S］0.9/［S］0.1=9Km19Km=81
，即达90% vmax与达10% vmax所需底物浓度之比总是81。同样也可得到达70% vmax与达10% vmax所需底物浓度之比总是21。
在米氏方程曲线图33(a)中，v随［S］增加的反应有三个特性区。如将一级动力学区(［S］0.1Km
)放大，则v~［S］
曲线主要是线性的，即根据实验测得的酶促反应速度与［S］成正比，如图33(b)所示。


图33(a)根据米氏方程所作的v~［S］曲线


这也就是酶促反应初速度区。在一级速度区，由于［S］Km
，所以v=vmax［S］Km=k［S］。从这个方程可知，一级速度常数k=vmaxKm。


图33(b)在［S］0.1Km狭窄范围内的v［S］

曲线(即酶促反应的初速度范围)

k的化学意义： 底物在单位时间转变成产物的量。例如k=0.02min-1
，就意味着底物在1min内会有2%转变成产物； 若k=2.3min-1=0.0383s-1
，那就意味着每秒钟有3.83%的底物变成产物。要测定任一时间范围内底物的消耗量或产物的生成量，可用一级速度方程积分。

v=-d［S］dt=k［S］

即-d［S］［S］=kdt。
从t=0
至t=t
，以及［St］
至［S］之间积分得： 


图34一级速度方程lg［S］对t作图


-∫［S］［St］d［S］［S］=∫t0kdt

所以-ln［S］［St］=kt
或［S］［St］=e-kt
所以［S］=［St］e-kt
两边取对数得： 

lg［S］=-k2.3t+lg［St］(34)


将lg［S］
对t
作图得34图。
图34中的t1/2
是使原有底物的一半转变成产物所需的时间。对一级反应来说

,它是一个常数。

2.3lg10.5=kt1/2，


所以kt1/2=0.692，
t1/2=0.692k。
t1/2是一个常数。
3.1.3分析酶促反应速度的作图法
要从实验数据所得到的v~［S］
曲线来直接决定速度的极限值vmax
是很困难的，因此Km
值也不易准确地由此法求得。为了克服这些困难，可设法将米氏方程重排变成不同形式的线性方程，然后将所得初速度数据，根据各线性方程作图，可求得各动力学常数。
3.1.3.1双倒数作图法
将式（33）米氏方程两边取倒数,得线性方程： 

1/v=Kmvmax·1［S］+1vmax(35)


将实验所得的一些初速度数据v和［S］取倒数，得各种1/v和1［S］
值； 将1/v对1［S］
作图，得一直线。按式(35)，该直线纵截距=1vmax
，斜率=Kmvmax
，故横截距=-1Km
(图35)。从而可直接测得1vmax
和-1Km
，而计算出vmax
和Km。
应用双倒数作图法处理实验数据求vmax
和Km等动力学常数比较方便，也是应用最广泛的一种方法。但要获得较准确的结果，实验时必须注意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km附近。图35是根据［S］在0.33~2.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图，从此图可准确地测量出-1Km
和1vmax。
如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1vmax
，但由于直线斜率近乎零，-1Km
则难以测得。例如，图36是根据［S］在3.3~20Km范围的实验结果而做出的双倒数图，从图中无法测得-1Km。

［S］在0.33~2.0Km范围内的实验数据所作的图


图35米氏方程的双倒数作图




图36［S］Km时的双倒数图


如果［S］比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点，使-1Km
和1vmax
都难以测准。如图37是根据［S］在0.033~0.20Km范围所作的图。


图37［S］Km时的双倒数图


上面三个双倒数图，只有当［S］为0.33~2.0Km时是正常的。如当Km=1×10-5mol/L
时，则实验所取底物浓度范围应在0.33×10-5mol/L~2.0×10-5mol/L
。
一般来说，选底物浓度应考虑能否得到1［S］
的常数增量。例如，当所选［S］为1.0、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10.0时，则1［S］
为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，为常数增量。反之，所选［S］为常数增量，如为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10时，则1［S］
的值为0.1、0.111、0.125、0.143、0.167、0.20、0.25、0.333、0.5、1.0； 在作图时，这些点将集中于1/v轴附近，而远离1/v轴的地方只有很少点，而这些点对于决定所作直线的走向却至关重要。
3.1.3.2其他线性作图法
1.  HanesWoolf作图法

将米氏方程重排为线性方程： 

［S］/v=1vmax［S］+Kmvmax(36)




图38［S］/v对［S］作图

从各实验数据v和［S］
，算出 ［S］/v，以［S］/v对［S］作图(图38)，可直接测得-Km
和Kmvmax
。
2.  WoolfAugustinssonHofstee作图法
将米氏方程重排为线性方程： 

v=-Kmv/［S］+vmax(37)


以v对v/［S］ 作图(图39)，可直接测得vmax
和vmaxKm
。
3.  EadieScatchard作图法
将米氏方程重排为线性方程： 

v/［S］=-vKm+vmaxKm
(38)


以实验数据v/［S］对v作图(图310)，可直接测得vmax
和vmaxKm
。



图39v对v/［S］作图




图310v/［S］对v作图


以上三种作图法也应注意选择底物浓度，不要使［S］比Km高得多或低得多。
上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图法应用最广泛。但此法有两个缺点： 第一，在v~［S］
图上，由相等增值而给出的等距离各点，在双倒数图上变成非等距离的点，且多数点集中在1/v轴附近，而远离1/v轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是主观目测以确定直线最权重的那些点。第二，在测定v时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度下更为敏感，因在高1［S］
值所得的一两个不准确的点，会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择适当的［S］，使1［S］
为等距离增值而得到克服。对第二个缺点关键要注意在低底物浓度下使所测初速度误差尽可能减小。
［S］/v对［S］作图，［S］未取倒数。另两个线性作图法，v未取倒数。前者对等距离［S］增值所测数据作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下测定误差较大时使用，比其他方法更可靠。
尽管以上三种线性作图法各有其优点，但因v与［S］出现在同一个轴上，要很容易地做出直观判断是不可能的。而双倒数图两个变量出现在两个不同轴上，则很易做出直观判断。在实际应用上，如果所选实验数据是正确的，或已被正确地加权，则任何一种线性作图法都是可用的。
在鉴别催化同一反应的多种酶存在时，v/［S］对v作图比双倒数作图更有用。例如，当鉴别催化同一反应的二酶(vmax1=vmax2
，Km相差10倍)混合物时，用相同［S］进行实验，实验数据所作的双倒数图只在极低1［S］
区才显示偏离线性，一般不易被觉察出，这样就可能得出只有单一酶存在的结论。而用v/［S］对v所作的图，各点分布均匀，且与线性的偏离，从整个v数据范围可明显看出该现象(图311和图312)。
4.  EisenthalCornishBowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该法是把［S］值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在纵轴上，然后把相应的v和［S］连成直线，这样所得的一簇直线交于一点，该交点坐标为Km和vmax
。从图313可以看出，任一［S］点和对应的v轴所形成的小三角形都与该［S］点和Km处虚线所形成的大三角形相似。前一情况，三角形两直角边之比为v/［S］，而后一情况，两直角边之比则为vmaxKm+［S］
。这正好与米氏方程相符，即v/［S］=vmaxKm+［S］。



图311催化同一反应的两个酶的双倒数图

虚线为单个酶，实线为二酶混合物，

vmax1=vmax2=
10, Km1=1,Km2=10




图312图311所示的两个酶及其混合物的

v/［S］对v作图





图313EisenthalCornishBowden作图法


5.  米氏方程的积分形式及其对数据的处理
米氏方程是一个微分方程，其v=d［P］dt
或v=-d［S］dt
。根据从米氏方程重排得到的线性方程作图求Km和vmax
时，在实验过程中所取数据必须限于初速度阶段，即只能是小于5%的［St］转变为［P］的阶段。但有些情况，例如，产物浓度过低难以测定； 或产物根本不能直接测定，而必须测定底物浓度的降低来反映产物的量(即［P］=［St］-［S］)。若只限于5%的底物发生反应就难以测准其降低的量。在这些情况下，如用积分速度方程处理，就不受这种限制。例如，在10%~90%的［St］转变为［P］的数据均可使用。因为积分方程在反应全过程中都是准确的。最简单的积分方程是在假定无产物抑制(即KmsKmp
)，并且Keq
很大的情况下导出，即把米氏微分方程v=-d［S］dt=vmax［S］Km+［S］
重排成vmaxdt=-Km+［S］［S］d［S］
，然后在t0
~t以及相应的［St］至［S］间积分,则： 

vmax∫tt0dt=-∫［S］［St］Km+［S］［S］d［S］=-Km∫［S］［St］d［S］［S］-∫［S］［St］d［S］

所以vmaxt=-Kmln［S］［St］-(［S］-［St］)=2.3Kmlg［St］［S］+［St］-［S］


此式可重排成各种线性形式，如 

2.3tlg［St］［S］=-1Km·［P］t+vmaxKm(39)
t［P］=Kmvmax2.3lg［St］［S］［P］+1vmax(310)


根据式(39)将2.3tlg［St］［S］
对［P］t
作图得一直线(图314)，其斜率和纵截距同式(38)，如图310所示。
按图314可直接测得vmaxKm
和vmax
，从而可算出Km
。这样的处理方法，可从比Km
大几倍的［St］(如［St］=10Km
)开始，将反应进行到［S］显著低于Km
(如［S］=0.1Km
)止，可得到如图314所示的极佳分布点。
6.  Lee和Wilson改良的双倒数作图法
改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为

1/v-=Kmvmax·1［］+1vmax(311)



图314米氏积分方程的一种作图法


其中，v-=［P］t=［St］-［S］t
，是t这一段时间内的平均速度； ［］=［St］+［S］2
，为反应过程中底物浓度的算术平均值。
由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的，用式(311)处理实验数据的准确性如何，可以通过式(311)和式(310)的对比，看1［］
是否与式(310)中的2.3lg［St］［S］(［St］-［S］)
值近似。现在设想一个反应已进行到30%的［St］
转变为［P］，令［St］
=1.0，则

［St］+［S］2=［］=1.0+0.72=1.72=0.85

所以1［］=1.18,