第1篇 医学微生物学 ·· 第1章病原微生物实验室 生物安全 [目的] 1掌握病原微生物安全分类及安全防护级别。 2熟悉病原微生物实验室生物安全防护，熟知生物安全标识。 一、病原微生物分类及安全防护级别 根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，中华人民共和国第424号国务院令《病原微生物实验室生物安全管理条例》中将病原微生物可分为以下4类。根据卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》（2006年1月11日），每一类又包括若干种（表11）。 表11病原微生物生物安全分类 病原微生物生物 安全分类 要求 数目 第一类 指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物 包括29种病毒 第二类 指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物 包括51种病毒、4种朊粒、10种原核细胞型微生物、4种真菌 第三类 指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物 给人类致病的常见微生物主要属于第三类微生物 第四类 指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物 第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。 根据病原体的危害程度，病原微生物实验室的生物安全防护水平（biosafety level,BSL）可分为4级，分别以BSL1、BSL2、BSL3和BSL4表示，其中BSL4的防护级别最高。不同生物安全防护水平的实验室的基本要求简介如下。 1 BSL1实验室：普通建筑物即可，有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计。在靠近出口处设洗手池、挂衣装置。墙壁、天花板和地面应平整、易清洁。实验室有适当的消毒设备。 2 BSL2实验室：满足BSL1要求。实验室门应带锁、可自动关闭并有可视窗。在实验室内应使用专门的工作服，应戴乳胶手套。配备生物安全柜、高压蒸汽灭菌器和洗眼设施。实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。 3 BSL3实验室：在建筑物中自成隔离区或为独立建筑物。由清洁区、半污染区和污染区组成，应有备用电源。安装独立的送排风系统以控制实验室气流方向和压力梯度，确保实验室内不出现正压和生物安全柜内气流不倒流。有符合生物安全工作要求的Ⅱ级和Ⅲ级生物安全柜。在污染区和半污染区出口处设非手动开关洗手装置。清洁区设置淋浴装置。下水直接通往独立的液体消毒系统集中收集，经有效消毒后处置。 第1章病原微生物实验室生物安全 第1篇医学微生物学 4 BSL4实验室：分为安全柜型、正压服型和混合型实验室。 安全柜型BSL4实验室建造在独立建筑物内或建筑物中独立的完全隔离区域内，该建筑物远离城区。由清洁区、半污染区和安放有Ⅲ级生物安全柜的污染区组成。气流及压力梯度的要求同BSL3实验室。 正压服型BSL4实验室由BSL4级实验设施、Ⅱ级生物安全柜和具有生命支持供气系统的正压防护服组成。进入污染区的工作人员应穿着正压防护服。 BSL1和BSL2防护级别的实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。BSL3和BSL4实验室在满足相关条件后方可从事高致病性病原微生物的实验活动。 在动物感染的实验研究中，以ABSL1、ABSL2、ABSL3、ABSL4表示包括从事动物在体（in vivo）操作实验室的相应生物安全防护水平。动物实验室同时应考虑动物实验操作（如染毒、医学检查、取样、解剖、动物尸体及排泄物的处置等）过程产生的潜在生物危害的防护。应特别注意对动物源性气溶胶的防护，例如对感染动物的剖检应在负压剖检台上进行。 二、病原微生物实验室生物安全防护 1生物安全柜（biological safety cabinet，BSC）：生物安全柜为负压过滤排风柜。可防止操作 者和环境暴露于实验过程中产生的生物气溶胶。其防护原理如下：送入安全柜工作区的空气经 图11生物安全柜工作原理 示意图（侧面） 过高效空气过滤器（high efficiency particulate air filter，HEPA）过滤，在安全柜内形成百级洁净度的环境，从而保护了操作对象；从安全柜排出的空气经过HEPA过滤释放，以保护环境；安全柜内形成的副压和气幕可以防止气溶胶外泄，从而保护了操作者（图11）。根据正面气流速度，送风、排风方式，将生物安全柜分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级3种类型。可产生含生物因子气溶胶的操作均应在生物安全柜中进行。 2个人防护装备：生物安全实验室必须要求有符合国家有关标准的个人防护装备。包括防护服、口罩（包括N95口罩和N98口罩）、手套、安全眼镜、面部防护罩、防水鞋套、紧急洗眼器等，必要时配备个体独立呼吸器。当防护服被危险材料污染时应立即更换，离开实验室区域之前应脱去防护服。 高致病性病原微生物必须在BSL3和BSL4防护级别的实验室从事实验活动，个人防护要求级别高。 生物安全第三类的病原微生物，在进行活菌操作时，一般要求在符合BSL2防护级别实验室的生物安全柜中进行，要求穿工作服，戴手套。试验时如发生污染要及时进行消毒处理。 3建立实验室安全管理体系：病原微生物实验室必须建立完善的实验室生物安全管理体系。 （1）成立生物安全委员会：明确实验室生物安全负责人及责任制；强化实验室日常管理如人员培训考核，领取登记、灭菌登记制度，研究人员的免疫，消毒隔离制度，实验室准入制度，事件、伤害、事故和职业性疾病的报告制度，危险标识制度，意外事故的紧急处理及撤离制度，各类垃圾的处理制度等。 （2）制定、完善和执行标准操作规程。 （3）安全的工作行为：进入病原微生物实验室的各类工作人员，必须熟悉和执行各项管理制度。养成良好的洗手习惯；接触生物源性材料时做好防护工作，使用合适、合格的器械和材料。应培训实验室工作人员安全操作尖利器具及装置。禁止用手对任何利器剪、弯、折断、重新戴套或从注射器上移去针头。实验室内尽可能减少使用刀、剪等利器，尽量采用替代品；正确使用生物安全柜，防范气溶胶产生、扩散及吸入；妥善处理感染性、损伤性及化学性废弃物。 （4）对进入实验室工作的各类人员进行病原微生物实验生物安全培训和考核，考核合格者方可进 图12生物安全标识 入实验室工作和学习。 医学类本科生初次进入病原微生物实验室，任课或辅导教师必须对他们进行实验室生物安全的系统培训，培养他们建立病原微生物实验室的安全工作行为。这将对顺利、安全地完成《医学微生物学》实验教学及今后从事病原微生物相关的工作打下坚实的基础。 三、生物安全标识 生物安全标识见图12。 （韩俭） 第2章细菌的形态检查 第2章细菌的形态检查 [目的] 1熟悉普通光学显微镜油镜的使用和保护技术。 2掌握细菌染色制片及革兰染色方法、结果判断。 3掌握细菌的基本形态和特殊结构。 4了解细菌不染色标本的观察方法。 一、普通光学显微镜油镜的使用和保护 微生物的个体微小，肉眼难以看见，必须借助显微镜（microscope）才能观察到，因此，显微镜是进行微生物研究必需的实验工具。显微镜种类很多，包括光学显微镜、电子显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜等。不同显微镜的原理和用途各异。此处仅介绍普通光学显微镜的使用及其保护。 图21光学显微镜结构模式图 普通光学显微镜是1676年由荷兰人Antony van Leeuwenhoek发明，由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成（图21）。光学显微镜的接物镜包括低倍镜、高倍镜和油镜，其放大倍数依次为10倍、40倍和100倍。目镜的放大倍数为10倍。显微镜的放大倍数以接物镜放大倍数乘以目镜的放大倍数计算。光学显微镜以可见光为光源，可见光的波长为04~07μm，平均约05μm。光学显微镜的分辨率为光波波长的一半，即025μm，经油镜放大1000倍后可达025mm。人的肉眼便能看清。一般细菌直径都大于025μm，因此可用光学显微镜观察形态。 1油镜的使用原理：油镜头的放大倍数大，但是透镜的孔径小。当光线经过玻片经空气进入镜头时，由于玻璃和空气的介质密度不同而发生折射现象，使得进入镜头的光线少而视野不清。采用与玻璃折光率（n=152）相近的介质香柏油（n=1515）加于玻片和油镜之间，减少了光的折射，增加了进入透镜的光线，使视野的亮度增加，获得清晰的物象（图22）。 2油镜的使用方法 （1）显微镜直立于桌面，勿将镜臂弯曲，以免液体标本和镜油流出。将标本（标本面向上）置于载物台上。 （2）光源及调光：显微镜可以以间接自然光、日光灯或钨丝灯光作为光源。用低倍镜（10×）对光，左眼通过目镜观察，用手调节反光镜，自然光源用平面镜，日光灯用凹面反光镜。如果是钨丝 图22使用油镜时加镜油的原理灯光，需加蓝色滤光片除去黄光。自带电源灯光的显微镜，在开启电源后可用光源滑动变阻器调节光线的强弱。 根据需要调节聚光器的高低和光圈的大小。一般检查未染色标本（如活菌运动）时，光线应弱一些，此时需降低聚光器，缩小光圈。检查染色标本时需光线强，应将聚光器升到最上，光圈完全打开。 （3）显微镜调节：将载玻片上标本所在部位移动到视野中央，用低倍镜找出标本的视野，寻找到需要观察的目标，移动到视野最中央。微生物标本可能在低倍镜下看不清具体的目标，可将标本存在的部位移到视野中央。于标本上滴加镜油1滴，换用油镜观察。要准确识别油镜头，油镜头上标有放大倍数（100×）或刻有“HI”（homogore immersions）、“oil immersion”的字样（切忌将高倍镜误认为油镜使用）。将油镜头转到中央后，用眼从侧面观察，转动粗螺旋，使载物台缓缓上升（或油镜头缓缓下降），至油镜浸入油中接近玻片为止（注意调节粗螺旋时不要用力过猛、过急，以免损坏镜头或压坏标本）。然后用左眼通过目镜观察，同时再沿相反方向缓缓转动粗螺旋下降载物台或上升油镜头，当见到模糊图像时，停止使用粗螺旋，转动细螺旋，上下调节即可见到清晰的物象。 （4）标本观察：观察标本时，两眼宜同时睁开，减少眼睛疲劳，最好用左眼观察，右眼配合绘图和记录。一边观察，一边移动标本片，寻找理想的视野仔细观察。 （5）油镜使用后的处置：转动粗螺旋，使载物台下降（或使镜筒上升），取出标本玻片，用擦镜纸擦去油镜上的香柏油，再用擦镜纸蘸少量二甲苯（不能用酒精）擦去沾在油镜上的镜油，最后用擦镜纸擦净二甲苯。长期不用时，把镜头转成“八”字形，套上镜套放入显微镜柜中。 3显微镜的保护要点 （1）显微镜应放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方，不使用时，用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来，也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内放置干燥剂，防止长霉。 （2）显微镜要避免与酸、碱、乙醚和酒精等化学物品接触，以免受损。 （3）搬动时应一手提镜壁，另一手托镜座，让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落。不得随意拆卸零部件。 （4）保持目镜和接物镜的清洁。特别是油镜使用后，用擦镜纸蘸少量二甲苯擦去镜油，再用擦镜纸擦净二甲苯。 二、细菌不染色标本检查法 [原理]鞭毛（flagellum）是细菌的运动器官，有鞭毛的细菌能在液体环境中自由运动，其运动有趋向性，常向营养物质处运动或逃离有害物质。许多杆菌与弧菌有鞭毛，球菌一般无鞭毛。不染色标本直接观察可用于某些细菌活菌运动的鉴别和诊断。如患者“米泔水样”的粪便滴片观察有助于霍乱弧菌感染的快速诊断。常用压滴法或悬滴法。 [仪器和材料] 1培养基和菌种：肉汤培养基、葡萄球菌、变形杆菌。 2器材：光学显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、凡士林、小镊子。 [方法]取葡萄球菌和变形杆菌菌种，接种肉汤培养基，37℃培养12小时备用。 第1篇医学微生物学 1压滴法 （1）用接种环分别蘸取葡萄球菌及变形杆菌菌液2~3环，置于洁净载玻片中央。 （2）用小镊子夹一盖玻片，先使盖玻片一边接触菌液，然后缓慢放下，覆盖于菌液上，避免菌液中产生气泡。 （3）先用低倍镜观察，找到标本所在部位，再换高倍镜观察细菌运动。在观察时应下降聚光器、缩小光圈，以减少光亮，使视野变暗，有助于观察。 2悬滴法 （1）取洁净凹玻片2张，在每个凹窝四周涂凡士林少许。 （2）用接种环分别取1环变形杆菌和葡萄球菌肉汤培养物加于盖玻片中央。 （3）将2张凹玻片分别倒合于盖玻片上，使凹窝中央正对菌液。 （4）迅速翻转载玻片，用小镊子轻压盖玻片，使之与凹窝边缘粘紧封闭，以防水分蒸发。 （5）先用低倍镜找到悬滴，再换高倍镜观察。 [结果]变形杆菌运动活泼，可向不同方向迅速运动，位置移动明显。葡萄球菌不能作真正运动，但受水分子的撞击即在一定范围内作往复颤动（布朗运动），位置移动不大。 三、细菌的革兰染色 细菌菌体小且呈半透明，除观察活菌运动外，一般需染色后才能较清楚观察。常用的染色方法包括单染法、复合染色法和负染法3大类（详见第3篇）。此处仅介绍常用的革兰染色法（Gram stain）。 革兰染色法是1884年由丹麦细菌学家Hans Christian Gram发明的染色方法。通过革兰染色，可将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。革兰染色的结果具有重要意义：①鉴别细菌：标本中的细菌经革兰染色后，可根据其形态、排列和染色性初步识别细菌，缩小鉴别范围，有助于进一步鉴定；②帮助临床选择用药：革兰阳性菌和革兰阴性菌对不同抗生素的敏感性不同；③判断细菌的致病性：革兰阳性菌和革兰阴性菌产生的致病物质及致病机制不同，前者主要通过产生外毒素致病，后者既可能产生外毒素，又可能产生内毒素致病。 [原理]革兰染色的原理尚未完全明确，一般认为和细菌细胞壁结构、等电点等有关。革兰阳性菌细胞壁厚，肽聚糖达20~50层，肽聚糖立体网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，阻止结晶紫碘复合物被脱掉，同时，革兰阳性菌的等电点为2~3，与碱性染料结合更牢固。因此最后呈紫色。革兰阴性菌肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，同时乙醇可以破坏细胞壁外层的脂含量高的外膜，将结晶紫碘复合物溶出细胞壁。同时革兰阴性菌的等电点为4~5，与碱性染料的结合不及革兰阳性菌牢固。因此用稀释复红复染后被染成红色。 [仪器和材料] 1取葡萄球菌和大肠埃希菌18小时的肉汤培养液各1ml，混合后制成试验用菌液。 2染色液：结晶紫溶液，卢戈（Lugol）碘液，95%乙醇溶液，稀释复红染液。 3其他：显微镜、载玻片、吸水纸、记号笔、接种环、酒精灯、香柏油、擦镜纸、二甲苯。 [方法] 1制片：取洁净载玻片1张，用记号笔在一面的中央画一约1cm的圈。接种环灭菌后蘸取菌液一环，小心涂在载玻片另一面的圈内。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。涂片后自然干燥，并经火焰3次固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准。 2染色 （1）初染：加结晶紫液染色1分钟，自来水洗去染液。 （2）媒染：加卢戈碘液染色1分钟，自来水洗去染液。 （3）脱色：加95%乙醇溶液数滴，不时摇动约30秒，至无紫色脱落为止，水洗。 （4）复染：加稀释复红染液，染色30秒，水洗。 3镜检：用吸水纸吸去玻片上残余的水滴，用显微镜油镜观察，从染色性、形态和排列3方面描述镜检结果。 [结果]葡萄球菌被染成紫色，为革兰阳性菌，球形，呈散在或葡萄串状排列；大肠埃希菌被染成红色，为革兰阴性菌，杆状，呈杂乱无章排列。 影响革兰染色的因素 （1）操作因素：涂片厚薄不均，过厚或过薄均可影响染色结果。固定时菌体过度受热可使形态、染色性改变。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。 （2）细菌因素：细菌在不同的生长条件和群体生长繁殖的不同时期，其生物学特性有差别，如葡萄球菌幼龄菌被染成紫色。而老龄菌被染成红色。细菌染色时最好用18～24小时的新鲜细菌培养物。 （3）染液因素：所有染色液应防止水分蒸发而影响浓度，卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色乙醇溶液以95%浓度为宜。 四、细菌的基本形态和特殊结构观察 [仪器和材料]显微镜、示教片、香柏油、擦镜纸。 [形态与结构观察] 1细菌的基本形态观察：在显微镜下看到的细菌形态包括球菌、杆菌和螺形菌。选取以下示教片，在显微镜油镜下观察，注意细菌形态、排列和染色性。 球菌：葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌。 杆菌：大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、白喉棒状杆菌（亚甲蓝染色）。 弧菌：霍乱弧菌。 2细菌的特殊结构观察：在光学显微镜下可观察到的细菌特殊结构包括荚膜、鞭毛和芽胞。细菌的菌毛在电子显微镜下可观察到。观察以下细菌示教片及其特殊结构。 肺炎链球菌（荚膜染色）、变形杆菌（鞭毛染色）、破伤风梭菌（芽胞染色）。 思考题 1试述细菌革兰染色的步骤、结果判断和意义。 2细菌的特殊结构有哪些？各有何生物学意义？ 3试分析细菌的细胞壁结构与革兰染色结果之间的关系。 （韩俭） 第3章细菌的生长与代谢 第3章细菌的生长与代谢 [目的] 1掌握细菌的分离培养方法及无菌操作技术，观察菌落特征。 2掌握固体平板和斜面、液体、半固体培养基的接种方法，观察细菌的生长现象。 3熟悉细菌培养基的制备原理。 4熟悉细菌常见生化反应的原理、方法和结果判定。 5了解数字编码鉴定技术的原理和结果判断。 一、细菌培养基及制备 培养基（culture medium）是将适合于细菌生长繁殖的各种营养物质用人工的方法配制成的营养基质。培养基含有所培养细菌必需的各种营养物质以及合适的pH，而且是无菌的。根据培养基的性质和用途可分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基和厌氧培养基。 培养基按物理性状可分为液体、半固体和固体3大类。在液体培养基中加入赋形剂琼脂（agar）可改变培养基的物理性状。加入2%琼脂，可制备成固体平板或斜面培养基。加入03%～05%琼脂可制备成半固体培养基。 培养基的制备原则 （1）充足的营养物质：培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质，有时候还需要根据培养细菌的特性加入特定的营养物质。 （2）合适的pH：培养基的pH应符合细菌生长要求，多数细菌生长的适宜pH值为72～76。有的细菌例外，如霍乱弧菌最适宜生长的pH值为88～92，结核分枝杆菌最适宜生长的pH值为65～68。 （3）培养基必须是的无菌的：所有培养基在制备结束时需要进行灭菌。不同的培养基灭菌的时间和温度不同，既要保证灭菌效果，又要保证不损失培养基的必需营养成分。 （4）培养基的质量检验：培养基经灭菌后，必须要求置37℃温箱中培养24小时无菌生长。同时将已知的标准参考菌株接种于相应的培养基上，经过37℃培养后细菌的生长繁殖状况和生化反应与预期的结果相符。 （5）所用器皿须洁净，忌用铁或钢质器皿。所用的化学试剂必须纯净，称取的分量务必准确。 培养基制备的基本程序：称量各种物质→溶解→测定及调整pH→滤过→分装→灭菌后备用。 常用基础培养基的制备。 [材料] 1牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、蒸馏水、氢氧化钠（1mol/L）、琼脂。 2高压灭菌器、试管、天平、量筒、锥形瓶、pH计或试纸、平皿、电炉或微波炉、吸管、37℃培养箱、烤箱、超净工作台、酒精灯。 [方法] 1肉汤培养基：称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g至锥形瓶，用量筒量取蒸馏水1000ml加入锥形瓶。搅拌或稍加热使之完全溶解后，用1mol/L NaOH调整液体pH值至76。用吸管分装至试管，加塞后置高压灭菌器灭菌（1213℃，20分钟）。冷却后取出。将肉汤置37℃细菌培养箱培养24小时，确定无细菌生长后（仍然为澄清透亮液体且管底无沉淀出现）方可应用。 2固体培养基：在100ml pH值78的肉汤培养基中，加入2~3g琼脂。加热溶化，用纱布过滤，补足蒸馏水并分装于试管和锥形瓶，试管加塞，二者同时置高压灭菌器灭菌（1213℃，20分钟）。取出后趁热斜置试管，冷凝后形成固体斜面培养基。锥形瓶取出后待培养基冷却到50～60℃时，在超净工作台中倾注于预先干烤灭菌的玻璃平皿中（每皿20ml），盖皿盖并在试验台面上轻轻移摇，使液体状态的培养基均匀铺满皿底。冷却后即形成固体琼脂平板培养基。将固体斜面和平板培养基置37℃细菌培养箱培养24小时，确定无细菌生长后方可应用。 琼脂系石花菜中提取的半乳糖胶，对细菌并无营养作用。琼脂具有特殊的物理性状，在98℃以上时会由固体溶化成为液体，一旦成为液体，需要在45℃以下才能够凝固。琼脂是制备细菌培养基理想和常用的固化赋形剂。琼脂多呈弱酸性，加入后使液体pH略下降，故一般采用pH值78的肉汤培养基制备固体培养基。 3半固体培养基：在100ml pH值78的肉汤培养基中，加入03～05g琼脂。加热溶化，用纱布过滤，补足蒸馏水并分装于试管，每管约2～3ml，加塞包扎后置高压灭菌器灭菌（1213℃，20分钟）。取出并冷凝后形成半固体培养基。将半固体培养基置37℃细菌培养箱培养24小时，确定无细菌生长后方可应用。 [保存]每批培养基作好制备记录并注明标签后，存放于阴凉暗处，最好置于普通冰箱冷藏保存。放置时间不宜超过1周。 二、细菌的接种技术及培养物的观察 （一）固体平板培养基接种法 固体平板培养基主要用于分离混杂的细菌标本，以获得细菌纯种。该法是通过在琼脂平板表面分区画线，使细菌分散生长形成单个菌落，有利于分离出目的菌。 [仪器和材料] 1菌种：大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌培养18～24小时肉汤培养物混合菌液。 2培养基：普通琼脂平板。 3其他：接种环、酒精灯、恒温培养箱、生物安全柜、记号笔。 [方法] 1开启生物安全柜。右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷，取菌种混合菌液一环。 2将琼脂平板倒放于桌面，左手持平板底部（皿盖留在桌上），使琼脂面尽量垂直，以减少空气中杂菌落入，并靠近火焰附近操作。 3右手握持蘸菌的接种环涂布于平板表面上端，用接种环来回画线，密密涂布（约占整个平板面的1/10），形成1区。画线时接种环与琼脂表面约呈30°～40°轻轻接触，用指力轻快地滑移，不可用力太大，以免划破琼脂。 图31平板分区画线分离法 4烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷，换方向画线，将接种环通过1区连续2~3次画线于2区；以同样的方法依次画3区、4区或5区（图31）。 5画线完毕，灭菌接种环放回原处。将平板倒置于皿盖内，在平板底部用蜡笔或标签注明标本名称、接种日期及接种者等信息。 6平板倒置于37℃培养18～24小时后观察结果。 [结果]取出平板观察菌落分布情况，注意4～5区是否有单个菌落，观察菌落特征，比较两种菌落的差异。不在画线上的菌落，是空气中落入的杂菌。 细菌在固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别。观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。观察时注意菌落的大小、形态、边缘、表面性状、隆起度、颜色、透明度以及所产生的色素等性状。若是血液琼脂平板，应观察菌落周围是否溶血以及溶血情况如何。菌落的观察要点如下： 第1篇医学微生物学 （1）大小：以直径（）（mm）表示。1mm左右为小菌落，2～3mm为中等菌落，＞3mm为大菌落。 （2）形状：圆形、卵圆形及不规则形。 （3）边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等。 （4）表面性状：光滑、湿润、皱纹、干燥等。 （5）隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等。 （6）透明度：透明、不透明、半透明。 （7）颜色：无色、白色、黄色、绿色等。 （8）溶血性：分为完全溶血、不完全溶血及不溶血。 （9）气味：有些气味对鉴别细菌有意义。 （10）黏稠度：黏稠、稀薄等。 在标本中菌量较大时，往往在画线的1区和2区，细菌生长后连成一片，没有形成菌落，称为菌苔（lawn）。 （二）固体斜面培养基接种法 固体斜面培养基可用于纯种细菌培养特性及生化反应观察，也可用于短期保存部分菌种。 [仪器和材料] 1菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌18～24小时斜面培养物。 2培养基：普通琼脂斜面。 3其他：接种环、酒精灯、恒温培养箱、生物安全柜、记号笔。 [方法] 1在待接种琼脂斜面培养基的试管壁上用记号笔作好标记。 2将菌种和斜面培养基的两只试管平行放在左手上，用拇指与其他四指夹住，两试管的管口齐平。右手持接种环烧灼灭菌。 图32纯种细菌接种法 A琼脂斜面接种；B液体培养基接种； C半固体培养基接种 3以右手手掌与小指、小指与无名指分别取下并夹持两试管棉塞，试管口通过火焰灭菌。 4将灭菌过的接种环伸入菌种管，挑取细菌后移出。 5迅速将蘸有菌种的接种环伸入待接种琼脂斜面底部，自底部向上行拉一线，然后再从底部向上轻轻作蜿蜒画线直至斜面顶端(图32)。 6画线完毕，管口通过火焰灭菌并塞好棉塞。接种环灭菌后放回原处。置37℃温箱培养18～24小时，观察结果并记录。 [结果]细菌在斜面培养基上形成菌苔，其中金黄色葡萄球菌的菌苔呈金黄色，大肠埃希菌的菌苔呈灰白色。 （三）液体培养基接种法 液体培养基主要用于无污染、菌量少标本（如血液、穿刺液等）的增菌，提高阳性率。许多细菌生化反应（如糖发酵试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验等）的检测在液体培养基中进行。 [仪器和材料] 1菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌18～24小时斜面培养物。 2培养基：液体培养基。 3其他：接种环、酒精灯、恒温培养箱、生物安全柜、记号笔。 [方法] 1在待接种的液体培养基试管壁上作好标记。 2按琼脂斜面接种法，以无菌操作自菌种管取菌少许。 3斜持试管，将带有细菌的接种环移入待接种肉汤管中，在液面和管壁交界的地方轻轻研磨，使细菌分散于培养基中（图32）。 4管口灭菌后加塞，接种环灭菌后放回原处。置37℃温箱培养18～24小时，观察并记录结果。 [结果]细菌在液体培养基中一般可出现以下3种生长现象：均匀混浊、沉淀生长和表面生长（形成菌膜）。 （四）半固体培养基接种法 半固体培养基主要用于观察细菌有无动力及作生化反应，常用的包括普通半固体琼脂培养基、明胶培养基、动力吲哚脲酶（motility indole urea，MIU）培养基等。 [仪器和材料] 1菌种：金黄色葡萄球菌、变形杆菌18～24小时斜面培养物。 2培养基：普通半固体琼脂培养基。 3其他：接种针、酒精灯、恒温培养箱、生物安全柜、记号笔。 [方法] 1取两支半固体培养基，在管壁上作好标记。 2同斜面培养基接种法操作，以无菌操作分别用接种针挑取金黄色葡萄球菌和变形杆菌菌种，各接种1支半固体培养基。接种时由半固体表面的中心垂直插入直至近底部，但不能插到管底，然后沿原穿刺线退出（图32）。 3管口灭菌后加塞，接种针灭菌后放回原处。 4置37℃温箱培养18～24小时，观察比较两支半固体培养基中细菌生长后穿刺线及其周围培养基的混浊程度，记录结果。 [结果]若细菌只沿穿刺线生长，穿刺线清晰，穿刺线以外的培养基仍澄清，表示细菌无动力；若细菌向四周弥散生长，穿刺线模糊或呈根须状，整个培养基变混浊，表示细菌有动力。 三、细菌的培养方法 根据细菌标本及培养目的不同，可采用不同的方法，常用的有以下3种： （一）一般培养法 一般培养法又称需氧培养法。将已接种好的平板、斜面、半固体和液体培养基等置于37℃温箱中培养18～24小时，无特殊要求的细菌均可生长。少数生长缓慢的细菌需要培养3～7天甚至1个月才能生长。为使温箱内保持一定的湿度，可在其内放置1杯水。对培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡凡士林封固，以防培养基干裂。 （二）二氧化碳培养法 某些细菌如脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌等，需在低氧压以及5%～10%CO2的环境中进行培养。常用的培养法如下： 1烛缸法：将接种好的培养基放置于有盖磨口标本缸或玻璃干燥器内，缸盖及缸口涂以凡士林，缸内放入一段点燃的蜡烛，加上缸盖密闭后，烛火因氧气减少而自行熄灭，此时缸内CO2的含量约为5%～10%，将烛缸置于37℃温箱中培养。 2化学法：常用碳酸氢钠盐酸法。按每升容积称取碳酸氢钠04g与浓盐酸035ml的比例，分别置于容器（平皿）内，连同容器（平皿）置于装有培养基的标本缸或玻璃干燥器内，盖紧缸盖密闭后倾斜缸位使盐酸与碳酸氢钠接触而生成CO2。将标本缸或玻璃干燥器置于37℃温箱内培养。 3 CO2培养箱法：CO2培养箱能自动调节CO2的含量、温度和湿度，培养物置于培养箱内，孵育一定时间后可直接观察生长结果。 （三）厌氧培养法 厌氧菌对氧敏感，培养过程中需在无氧的环境下才能生长。厌氧培养方法很多，较常用的有以下几种：厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱培养法、庖肉培养基法、平皿焦性没食子酸法等，详见第9章厌氧性细菌。 四、细菌的代谢产物检查 细菌分泌胞外酶将多糖、蛋白质等高分子营养物质分解为单糖、肽或氨基酸，然后吸收进入菌体，再经氧化或胞内酶分解形成菌体可利用的成分，此谓细菌的分解代谢。在分解代谢过程中，由于不同的细菌可产生不同的酶，因此分解同一种底物可产生不同的产物，在培养基中预先或培养后加入特定指示剂，根据指示剂的改变可鉴别细菌，通常称为细菌的生化反应。生化反应现广泛应用于细菌的鉴定和诊断。细菌的生化反应种类很多，概括起来包括以糖类为底物的代谢试验、蛋白质或氨基酸代谢试验、碳源和氮源利用试验以及各种酶类试验。 [仪器和材料] 1菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌、金黄色和白色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、链球菌18～24小时斜面或液体培养物。 2培养基：各种单糖发酵管（葡萄糖、乳糖、甘露醇）、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、醋酸铅培养基、尿素培养基、枸橼酸盐培养基、普通琼脂培养基。 3试剂：靛基质试剂、甲基红试剂、VP试验甲液（6%α萘酚乙醇溶液）、乙液（40%KOH）、氧化酶试剂、3%过氧化氢。 4器具：接种环、接种针、酒精灯、恒温箱、滴管、载玻片、滤纸。 [方法] 1糖（甘、醇）类代谢试验 （1）糖发酵试验：不同种细菌含有不同的糖（甘、醇）分解酶，分解糖（甘、醇）的能力不同，代谢产物也不同。有的细菌分解糖（甘、醇）的产物为酸和气体，有的只产酸不产气，有的不分解。根据指示剂颜色的变化来判断和鉴别细菌。 1）将大肠埃希菌、伤寒沙门菌分别接种于葡萄糖、乳糖和甘露醇3种糖发酵管内。 2）置37℃培养18～24小时，取出观察并记录结果。 （2）甲基红试验：某些细菌可分解葡萄糖产生丙酮酸，继而进一步分解产生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至45以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性。有些细菌分解葡萄糖产酸量少或产生的酸进一步被氧化为醇、酮等非酸性物质，培养基pH值为62以上，加入甲基红试剂呈橘黄色，为甲基红试验阴性。 1）将大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中。 2）置37℃培养48～72小时。 3）取出培养物，各滴加2滴甲基红试剂摇匀，判定结果。 （3）VP（VogesProskauer）试验：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在碱性环境下被氧化为二乙酰，再与培养基中蛋白胨所含精氨酸的胍基结合，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。 1）将大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中。 2）置37℃培养48小时。 3）取出培养物，按每毫升培养液中加入VP试验甲液05ml及乙液02ml，摇匀混合后静置5～15分钟，观察并记录结果。 2蛋白质和氨基酸代谢试验 （1）吲哚（indol）试验（又称靛基质试验）：某些细菌具有色氨酸分解酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，产生无色靛基质（吲哚），加入靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛）后生成玫瑰色化合物，为吲哚试验阳性。 1）取蛋白胨水培养基2支，分别接种大肠埃希菌和产气肠杆菌。 2）置37℃培养18～24小时。 3）取出培养物，沿管壁徐徐加入约05ml靛基质试剂于培养物中，轻轻摇动，静置数分钟后观察并记录结果。 （2）硫化氢试验：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸如胱氨酸、半胱氨酸，生成硫化氢，硫化氢可与培养基中的铅离子或2价亚铁离子反应生成硫化铅或硫化亚铁，呈现黑色。 1）取醋酸铅或枸橼酸铁培养基2支，分别接种大肠埃希菌与普通变形杆菌。 2）置37℃培养18～24小时。取出观察结果并记录。 （3）尿素酶试验：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变为红色，为阳性反应；不分解尿素者，培养基颜色不变，为阴性反应。 1）取尿素培养基2支，分别接种伤寒沙门菌和普通变形杆菌。 2）置37℃培养18～24小时，观察结果并作记录。 3其他试验 （1）枸橼酸盐利用试验：某些细菌能利用培养基中唯一的碳源枸橼酸盐，同时可利用铵盐作为氮源，因此可在枸橼酸盐培养基上生长，并分解枸橼酸盐产生碳酸盐，使培养基呈碱性，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源，则细菌不能生长，指示剂不变色（绿色），为枸橼酸盐利用试验阴性。 1）将大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于枸橼酸盐培养基中。 2）置37℃培养18～24小时，观察结果并作记录。 （2）触酶试验（又称过氧化氢酶试验）:某些细菌可产生触酶（过氧化氢酶），能分解过氧化氢释放出初生态氧，有气泡产生，为触酶试验阳性。 1）用接种环挑取金黄色葡萄球菌和链球菌的液体培养物，分别置于洁净玻片上。 2）滴加3%过氧化氢溶液数滴并观察结果。 （3）氧化酶试验：某些细菌（如铜绿假单胞菌）具有氧化酶，可使细胞色素C转化为氧化型，继而将盐酸二甲基对苯二胺氧化成紫红色的醌类化合物，为氧化酶试验阳性。 1）用接种环刮取铜绿假单胞菌和大肠埃希菌菌苔，分别涂抹于滤纸上。 2）用滴管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸上的菌苔上，立即观察结果。 4细菌色素观察：有的细菌可以产生色素（pigment）。细菌产生的色素有两类。一类为水溶性色素，能弥散到培养基或周围组织；另一类为脂溶性色素，只存在于菌落表面，培养基颜色不变。借助色素可以鉴别细菌。 （1）取普通琼脂平板培养基3支，采用分区画线的方法分别接种金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和铜绿假单胞菌于培养基上。 （2）置37℃培养18～24小时，取出平板，观察菌苔（或菌落）以及培养基颜色并作记录。 [结果] 1糖（甘、醇）类代谢试验 （1）糖发酵试验：大肠埃希菌分解葡萄糖、乳糖和甘露醇，产酸产气；伤寒沙门菌分解葡萄糖、甘露醇，产酸不产气；伤寒沙门菌不分解乳糖。 如果某种细菌分解糖（甘、醇）后既产酸又产气，以“⊕”表示，培养基指示剂（溴甲酚紫）由紫色变为黄色，液体培养基的倒立小管中有气泡产生；若为半固体培养基，则培养基内出现气泡或琼脂断裂。仅产酸不产气，以“+”表示，培养基指示剂由紫色变为黄色，小管中无气泡产生。不分解糖（甘、醇）者以“－”表示，培养基颜色与接种前相比无变化。 （2）甲基红试验：大肠埃希菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。 （3）VP试验：大肠埃希菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。 2蛋白质和氨基酸代谢试验 （1）吲哚试验：若试剂与培养基的接触面出现红色，则试验为阳性；若不出现红色，则试验为阴性。大肠埃希菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。 （2）硫化氢试验：培养基出现黑色为阳性，无黑色出现为阴性。普通变形杆菌为阳性，大肠埃希菌为阴性。 （3）尿素酶试验：培养基变红为阳性，颜色不变为阴性。普通变形杆菌为阳性，伤寒沙门菌为阴性。 3其他试验 （1）枸橼酸盐利用试验：如有菌苔出现，培养基变为深蓝色为阳性；细菌不生长、培养基不变色（绿色）为阴性。产气肠杆菌为阳性，大肠埃希菌为阴性。 （2）触酶试验：于30秒内有大量气泡生成者为阳性，不产生气泡者为阴性。金黄色葡萄球菌为阳性，链球菌为阴性。 （3）氧化酶试验：立刻出现红色，继而逐渐加深者为阳性；不变色者为阴性。铜绿假单胞菌为阳性，大肠埃希菌为阴性。 4细菌色素观察：铜绿假单胞菌产生水溶性绿色色素，金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌产生脂溶性金黄色和白色色素。 [注意事项] 1试验中要求严格无菌操作。 2避免使用陈旧培养物。 3滴加吲哚试剂后应及时观察结果，随着时间的推移，培养基表面上的红色化合物会扩散以致不清晰，从而影响结果判定。 4滴加VP试剂甲液和乙液后需摇匀。 5做氧化酶试验时，应避免接触含铁物质，否则易出现假阳性，氧化酶试剂要求新鲜配制。 6做触酶试验时，避免使用血平板培养物。 五、数字编码鉴定技术 [原理]预先根据细菌生化反应特点，计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和，统计学处理而得出一代表某种或某类细菌的编码。将各种生化反应培养基分装在微量孔或微量管内，组成系列试剂。进行细菌鉴定时，将待检细菌的纯培养物接种于每个微量孔或微量管内，37℃培养一定时间，根据指示剂颜色变化进行编码。计算单项发生频率和多项发生频率，得出鉴定百分率（%idd），经查阅编码检索本或计算机软件将编码转化为细菌名称。数字编码鉴定技术具有测定指标多，操作简便，适用范围广泛的特点。已应用于肠杆菌科细菌、非发酵革兰阴性杆菌的鉴定。 [仪器和材料] 1菌种：大肠埃希菌。 2培养基：肠杆菌科细菌微量培养管。 3试剂：靛基质试剂，VP试验甲液、乙液，氧化酶试剂等。 4器具：麦氏比浊管、计算机分析系统或编码检索本。 [方法] 以鉴定大肠埃希菌为例。 （1）初筛：将分离纯培养的细菌涂片，革兰染色后镜检，为革兰阴性杆菌；作氧化酶试验为阴性。根据该特点选择肠杆菌科细菌微量鉴定系统。 （2）制备细菌悬液：挑取平板上的单个菌落混悬于1ml无菌生理盐水中，使菌液浓度达05麦氏比浊度（15×108CFU/ml）。 （3）接种：将上述菌液接种于肠杆菌科细菌微量鉴定系统的微量孔内，置37℃培养18～24小时。结果观察方法有3种：自发反应可用肉眼观察颜色变化或培养液是否混浊；有些试验需添加试剂后方可出现颜色变化；有些试验需在紫外灯下观察荧光；观察后判断阳性（+）或阴性（－），并作记录。 （4）结果判断：按记录编码表的顺序，把3个生化试验编为一组，其顺序代号分别是1、2、4三个数字，即每组的第一个试验阳性为1分，第二个试验阳性为2分，第三个试验阳性为4分，阴性不算分。根据生化反应结果，将每一组分值相加，并依次排列组成编码，查阅编码检索本上与之相对应的细菌条目或用计算机分析，该编码所对应的细菌名称即为鉴定结果。 [结果] 1微量生化反应结果及编码如表31所示。 表31大肠埃希菌微量生化反应编码鉴定系统 VP 试验 硝酸盐 还原 试验 苯丙 氨酸 脱氨酶 硫化氢 试验 吲哚 试验 鸟氨酸 脱羧酶 试验 赖氨酸 脱羧酶 试验 丙二酸盐 利用 试验 尿素 分解 试验 七叶苷 水解 试验 ONPG 阿拉伯 糖分解 试验 侧金盏 花醇分 解试验 肌醇 分解 试验 山梨醇 分解 试验 反应 分值 124124124124124 结果 -+--+++---+++- - 编码26161 2本试验所得编码为26161，查阅编码检索本上相应细菌条目或计算机分析，最后鉴定为大肠埃希菌。 思考题 1细菌在液体培养基中有几种生长现象？ 2细菌在半固体培养基中的生长现象及其意义如何？ 3什么是菌落？在鉴别细菌上有何意义？ 4糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验、尿素酶试验的原理及其意义如何? （杨海波） 第4章外界因素对细菌代谢 的影响 [目的] 1了解微生物在自然界的分布，为医学实践中严格无菌操作打下基础。 2掌握热力灭菌的原理、常用方法及注意事项。 3验证紫外线的杀菌作用，熟悉紫外线的杀菌机制、作用特点及应用范围。 4了解滤过除菌的原理、特点及使用范围。 5验证常用化学消毒剂的杀菌、抑菌作用，了解化学消毒剂的杀菌机制。 6熟悉纸片琼脂扩散法抗生素药敏试验的原理、试验方法及结果判读。 7掌握噬菌体的溶菌现象和严格的宿主特异性。 一、微生物分布检查 [仪器和材料] 1培养基：普通琼脂平板、血琼脂平板。 2其他：无菌生理盐水、无菌棉拭子、无菌刻度吸管、25%碘酒溶液、70%乙醇溶液、记号笔、细菌培养箱。 [方法] 1空气中微生物的检查：取普通琼脂平板1块，用记号笔于平皿底面进行标记。打开皿盖，将培养基面向上暴露于室内空气中，10分钟后盖上皿盖，倒置于37℃孵箱中培养18~24小时，观察培养基表面菌落数量及其特征。 2常用物品表面细菌的检查：取普通琼脂平板1块，用标记笔在平皿底面画“十”字，将平皿平均分为4个区，并分别标记“试验台面、衣服、书本封皮、钢笔”等。用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水后，分别在试验台面、衣服、书本封皮、钢笔等物品表面轻轻擦拭，然后在相应标记培养基表面轻轻涂抹。培养皿倒置于37℃孵箱中培养18~24小时，观察培养基表面细菌生长情况。 3正常人体皮肤表面细菌的检查：取普通琼脂平板1块，用标记笔在平皿底面将平皿平均分为两区，分别标记“消毒前”、“消毒后”。受试者以示指或中指指腹在“消毒前”区域的培养基表面轻轻按压涂抹，然后将此手指以25%碘酒溶液、酒精消毒，待皮肤干后，在标记有“消毒后”区域培养基表面轻轻按压涂抹。将平皿盖好倒置于37℃孵箱中培养18~24小时，观察培养基表面细菌生长情况。 4咽喉部细菌的检查：取血琼脂平板，用标记笔在平皿底面标记。用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水后轻擦拭受试者口腔咽喉部黏膜，然后将无菌棉拭子在培养基表面轻轻涂抹。将培养皿倒置于37℃孵箱中培养18~24小时，观察培养基表面细菌生长情况。 [结果] 1空气中微生物的检查:平板表面可见有大小、形态、颜色和透亮度各异的多种菌落生长。 2常用物品表面细菌的检查：在平板各标记区域可见有数目不等的菌落或菌苔生长。 3正常人体皮肤表面细菌的检查：“消毒前”区域平板表面可见有菌落或菌苔生长，“消毒后”区域平板表面无菌落生长。 4咽喉部细菌的检查：血平板表面可见有不同形态菌落生长，有的菌落颜色呈灰白色，针尖大小，周围可见窄小草绿色溶血环。 二、物理因素对细菌代谢的影响 （一）温度对细菌代谢的影响 [原理]高温可使微生物蛋白质变性，核酸DNA断裂；对微生物有明显的致死作用。热力灭菌是最可靠而被普遍使用的灭菌方法，包括湿热灭菌法和干热灭菌法，前者的效率及效果优于后者。 [仪器和材料]大肠埃希菌及枯草芽胞杆菌16~18小时肉汤培养物、普通琼脂平板、肉汤培养管、水浴锅、无菌刻度吸管、记号笔等。 [方法] 1取8支肉汤培养管分成两组，每组4支。用记号笔分别标记“大肠埃希菌”及“枯草芽胞杆菌”。 2用无菌刻度吸管分别吸取大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌菌液接种于相应肉汤培养管中，每管01ml。 3每组各取3管置于100℃水浴，分别于水浴5分钟、15分钟、30分钟时每组各取一管置于冷水中使之迅速冷却。每组各留一管不加热作为对照。 4将两组共8支肉汤管置于37℃孵箱中培养18~24小时，观察生长情况。 [结果]各肉汤管细菌生长情况见表41。 表41各肉汤管细菌生长情况 5分钟 15分钟 30分钟 0分钟（对照） 大肠埃希菌 - - - + 枯草芽胞杆菌 + +/- - + 注：+，有菌生长；-，无菌生长。 （二）紫外线杀菌试验 [原理]波长为200~300nm的紫外线与DNA吸收光谱一致，细菌经紫外线照射后，可使DNA分子中相邻的胸腺嘧啶核苷形成二聚体，从而干扰DNA复制，使菌体死亡。紫外线杀菌作用强，但其能量低，穿透力弱，可被普通玻璃及纸张等吸收，因此紫外线只适用于物体表面消毒及空气（无菌室、手术室等）的消毒。 [仪器和材料] 1菌种：大肠埃希菌18~24小时琼脂平板培养物。 2培养基：普通琼脂平板。 3灭菌的黑纸片、镊子、紫外线灯、接种环、酒精灯、记号笔等。 [方法] 1取普通琼脂平板1块，在皿底用记号笔作出标记。接种环灭菌后刮取大肠埃希菌菌种，在