第 1章　如何在分子水平研究生命 ....... 1第 1节分子实验技术简史 ...................... 1第 2节分子实验技术体系 ...................... 4一、生物分子的分析鉴定 ...................4二、生物分子的人工合成 ...................5三、生物分子的人工改造 ...................5四、生物分子的功能研究 ...................6第 3节分子实验技术应用 ...................... 7一、电泳技术在临床检验中的应用 ...............................................7二、 DNA重组技术在医药卫生领域的扩展 ...................................7三、基因诊疗技术在未来医学的前景 ...............................................8四、动物模型在医学研究中的重要地位 .........................................................9

第 2章　从组织中分离纯化生物大分 子——大分子制备技术 .......... 10 第 1节材料预处理及细胞的分离 ........ 11 一、选择材料及预处理 .....................11 二、细胞的分离 .................................11 第 2节细胞破碎及细胞器分离 ............ 12 一、细胞的破碎 .................................12 二、细胞器的分离 .............................13 第 3节大分子的分离纯化与测定 ........ 13 一、蛋白质的分离纯化 .....................13 二、核酸的分离纯化 .........................14 三、蛋白质浓度的测定 .....................15 四、核酸的浓度、纯度及完整性 测定 .............................................17

第 4节生物大分子提纯后的处理 ........ 18 一、大分子样品的浓缩 .....................18 二、大分子样品的干燥 .....................18 三、大分子样品的保存 .....................19 第 5节实验练习 .................................... 20 一、蛋白质的盐析与透析 .................20 二、蛋白质含量测定 ........................21

第 3章　测定物质的吸收光谱——分光 光度技术 .................................... 24 第 1节　分光光度技术的基本原理 ........ 24 一、光的性质 .....................................24 二、光谱 .............................................25 三、 Lambert-Beer定律 .....................26 第 2节　分光光度计的基本结构 ............ 27 一、光源 .............................................28 二、分光系统 .....................................28 三、样品室 .........................................29 四、检测器 .........................................29 五、显示器 .........................................30 第 3节　常用分光光度计的使用方法 .... 30 一、 721型分光光度计 ......................30 二、 721e型分光光度计 ....................31 三、 722s型分光光度计 ....................31 四、 SP-756紫外 -可见分光光度计 ...31 第 4节　分光光度技术的应用 ................ 31 一、溶液的定性分析 .........................32 二、溶液的定量分析 .........................32 第 5节　实验练习 .................................... 33 一、蛋白质的定量测定 .....................33 二、脲酶 Km值测定 ..........................37 

三、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法） ...........................40

四、血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） ................................42

五、激素对血糖浓度变化的影响 .....43

六、血浆高密度脂蛋白 -胆固醇的测定 .........................................45

七、紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度 .............................46

第 4章　将混合物中各种组分分开—— 层析技术 .................................... 48 第 1节　层析技术概述 ............................ 48 一、层析技术的形成和发展 .............48 二、层析技术的基本原理 .................49 三、层析技术的分类 .........................49 四、层析技术的基本要求 .................50 第 2节　吸附层析 .................................... 50 一、吸附层析的原理 .........................50 二、吸附层析的操作 .........................50 第 3节　分配层析 .................................... 52 一、纸层析的原理 .............................52 二、纸层析的操作 .............................52 第 4节　凝胶过滤层析 ............................ 54 一、凝胶过滤层析的原理 .................54 二、凝胶过滤层析的特征常数 .........54 三、凝胶过滤层析的常用介质 .........55 四、凝胶过滤层析的操作 .................56 五、凝胶过滤层析的应用 .................57 第 5节　离子交换层析 ............................ 57 一、离子交换层析的原理 .................57 二、离子交换剂 .................................58 三、离子交换层析的操作 .................59 四、离子交换层析的应用 .................61 第 6节　亲和层析 .................................... 61 一、亲和层析的原理 .........................61 二、亲和层析的操作 .........................62 第 7节　实验练习 .................................... 63 一、氨基酸的分离鉴定——纸层 析法 .............................................63

二、转氨酶的活性鉴定——薄层层析法 .............................................64三、核苷酸的分离——离子交换柱层析法 .........................................65四、胰蛋白酶的分离纯化——亲和层析法 .........................................67五、血清蛋白质的层析分离——分子筛层析法 .............................68

第 5章　分离带电颗粒的有效手段—— 电泳技术 .................................... 69 第 1节　电泳技术概述 ............................ 69 一、电泳技术的形成和发展 .............69 二、电泳技术的基本原理 .................70 第 2节　影响电泳的因素 ........................ 71 一、溶液的 pH...................................71 二、缓冲液的离子强度 .....................71 三、电场强度 .....................................72 四、电渗作用 .....................................72 第 3节　常用电泳技术 ............................ 72

一、纸电泳和醋酸纤维素薄膜 电泳 .............................................72 二、凝胶电泳 .....................................73 三、等电聚焦电泳 .............................75 四、双向电泳 .....................................76 五、核酸电泳 .....................................77 六、印迹转移电泳 .............................79 第 4节　实验练习 .................................... 79

一、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 .............................................79二、血清乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳 .................................81三、血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 ...........................................82四、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 .........83五、 DNA琼脂糖凝胶电泳 ...............86六、限制性内切酶对质粒 DNA酶切产物的电泳鉴定 .................87 

VII …………

目　　录

第 6章　利用离心场沉降大分子—— 离心技术 .................................... 90 第 1节离心技术的基本原理 ................ 90 一、颗粒沉降的原理 .........................90 二、沉降系数 .....................................91 三、相对离心力 .................................91 第 2节　离心机的类型及操作规程 ........ 91 一、离心机的类型 .............................91 二、制备型离心机 .............................92 三、分析型离心机 .............................94 四、离心操作的注意事项 .................94 第 3节　制备型超速离心的分离方法 .... 95 一、差速沉降离心法 .........................95 二、密度梯度区带离心法 .................95 三、等密度梯度区带离心法 .............96 第 4节　实验练习 .................................... 96 一、肝糖原的提取和鉴定 .................96 二、酪蛋白的制备 .............................97 三、动物肝脏 DNA的提取 ..............98 四、酵母 RNA的提取及成分 鉴定 ...........................................100 五、质粒 DNA的提取与鉴定 ........101 六、感受态细菌的制备及质粒  DNA的转化 .............................104 七、蔗糖密度梯度离心分离 病毒 ...........................................106

第 7章　利用碱基互补探查核酸序列——分子杂交技术 ............ 109第 1节　核酸分子杂交的基本原理 ...... 109一、变性与复性 ...............................109二、建立在 DNA变性与复性基础上的核酸杂交技术 ...................110第 2节　核酸分子杂交的主要类型及程序 ...........................................111一、固相杂交的支持物 ...................111二、常用的转移方法 .......................112三、固相杂交的基本程序 ...............112四、固相杂交的主要类型 ...............113

第 3节　核酸探针的分类和标记 .......... 114 一、核酸探针的分类 .......................114 二、核酸探针的标记 .......................115 第 4节　实验练习 .................................. 117 一、 Southern杂交 ...........................117 二、 Northern杂交 ...........................118 三、组织原位杂交 ...........................120 四、斑点杂交 ...................................121

第 8章　微量 DNA的体外扩增——  PCR技术 ................................. 123 第 1节　 PCR技术概述 ......................... 123 一、基本原理 ...................................123 二、主要步骤 ...................................123 三、主要特点 ...................................124 第 2节　 PCR的反应体系及操作 ......... 125 一、 PCR反应体系 ..........................125 二、 PCR的操作及注意事项 ..........125 三、 PCR反应条件的优化 ..............127 四、 PCR产物的检测分析 ..............128 第 3节　 PCR的衍生技术 ..................... 128 一、逆转录 -PCR.............................128 二、实时荧光定量 PCR ..................129 三、特殊 PCR ..................................130 第 4节　 PCR技术的应用 ..................... 132 一、分子生物学领域 .......................132 二、临床医学领域 ...........................133 三、其他领域 ...................................134 第 5节　实验练习 .................................. 134 逆转录 PCR ......................................134

第 9章　阅读遗传天书的第一步——测序技术 .................................. 137第 1节　 DNA测序的基本原理 ............ 137第 2节　 DNA测序的常用方法 ............ 138一、酶学法——双脱氧链终止法 .......................................138二、化学（裂解）法—— Maxam-Gilbert测序法 ..........................140 

三、酶学法与化学法的比较 ...........141第 3节 DNA测序自动化 .................... 143第 4节实验练习 .................................. 144双脱氧链终止法测定 DNA序列 ....144

转基因技术 ........................... 147 第 1节转基因技术概述 ...................... 147 一、转基因动物技术的原理 ...........147 二、转基因动物技术的成果 ...........148 第 2节建立转基因动物的方法 .......... 149 一、目的基因的制备 .......................149 二、转基因动物的制备方法 ...........149 三、转基因小鼠 ...............................156 第 3节转基因动物的应用 .................. 156

一、研究基因的结构和功能及其表达与调控 ...............................156二、建立人类疾病动物模型 ...........157三、研究人类疾病基因治疗 ...........157四、利用转基因动物生产生物活性蛋白 ...................................157五、利用转基因动物生产人用器官移植的供体 .......................158六、利用转基因技术改良动物品种和生产性能 .......................158第 4节转基因的安全性问题 .............. 159一、转基因生物的安全性 ...............159二、转基因食品的安全性 ...............159第 5节实验练习 .................................. 160

一、转基因动物技术中外源基因的制备 .......................................160二、显微注射 ...................................161

第 11章　置换生物体的某种基因——基因打靶技术 ....................... 165第 1节基因敲除技术概述 .................. 165一、基因敲除技术的建立和发展 ...........................................165二、基因敲除的基本原理 ...............167第 2节基因敲除的方法及进展 .......... 170

一、条件性基因敲除法 ...................170 二、诱导性基因敲除法 ...................171 三、利用随机插入突变进行基因 敲除 ...........................................171 第 3节基因敲除小鼠的制备过程 ...... 174 一、目标载体的构建 .......................174 二、 ES细胞培养 .............................174 三、 ES细胞的转化 .........................175 四、挑克隆 .......................................175 五、抗性 ES细胞克隆的冻存 ........175 六、 ES细胞基因组 DNA的 提取 ...........................................175 七、克隆的分析和鉴定 ...................175 八、染色体分析 ...............................176 九、嵌合体小鼠的制备 ...................176 十、品系的建立 ...............................176 第 4节基因敲除技术的应用及缺陷 ... 177 一、基因敲除技术的应用 ...............177 二、基因敲除技术的缺陷 ...............178

第 12章　21世纪的生命科学技术—— 蛋白质组学技术 ................... 180 第 1节　蛋白质组学概论 ...................... 180 一、蛋白质组学 ...............................180 二、蛋白质组学研究的策略和 范围 ...........................................182 三、蛋白质组学发展趋势 ...............182 第 2节　蛋白质组学技术 ...................... 183 一、样品制备 ...................................183 二、样品分离技术 ...........................184 三、样品鉴定技术 ...........................190 第 3节　蛋白质组生物信息学 .............. 195 第 4节　实验练习 .................................. 196 一、家兔血清蛋白质组二维凝胶 电泳技术的建立 .......................196 二、正常人尿蛋白质组学研究 .......198

第 13章　蛋白质与核酸相互作用分析 ——EMSA和 ChIP技术 .....200第 1节　电泳迁移阻滞实验（EMSA）... 200 

目　　录

IX …………

一、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本原理 ...............................200二、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本操作步骤 .......................200第 2节　染色质免疫沉淀（ ChIP）技术 .......................................... 202一、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本原理 ...............................202二、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本操作步骤 .......................202第 3节　实验练习 .................................. 204一、经 EMSA验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-κB的量 .....204二、经 ChIP验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-κB的量 .....207

第 14章　蛋白质和蛋白质相互作用分析——酵母双杂交等技术 ....211第 1节　概述 .......................................... 211一、蛋白质相互作用的分子结构基础 ...........................................211二、蛋白质相互作用分析的意义 ...212三、相互作用蛋白质组学的研究技术平台 ...................................213

第 2节　酵母双杂交技术 ...................... 215一、酵母双杂交系统的原理 ...........215二、酵母双杂交系统的应用 ...........216三、酵母细胞内的高通量酵母

双杂交 .......................................216四、酵母双杂交系统的几个版本 ...216五、酵母双杂交系统的假阳性

问题 ...........................................217

第 3节　其他常用技术 .......................... 217一、细菌双杂交技术 .......................217二、噬菌体展示技术 .......................218三、依赖亲和力筛选相互作用

蛋白质的技术 ...........................219 四、蛋白质芯片技术 .......................221 第 4节　实验练习 .................................. 222

一、酵母双杂交技术筛选 TRAC-1相互作用蛋白 ...........................222二、 GST融合蛋白沉降技术筛选 RNF114相互作用蛋白 ............226

第 15章　科学发展的不竭源泉——技术创新 .................................... 230

第 1节　“三性”实验 ............................ 230一、“三性”实验的概念 .................230二、“三性”实验的特点和意义 .....230三、实验教学体系的改革 ...............231四、“三性”实验的基本要求 .........232五、“三性”实验的一般程序 .........232六、“三性”实验的选题原则 .........232七、“三性”实验的实施及评估 .....233

第 2节　实验练习 .................................. 233

一、酵母蔗糖酶的纯化及性质研究 ...........................................233二、猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 ...........................................238三、 DNA重组实验 .........................241

实验室管理 ...................................249

第 1节实验室规则 .............................. 249 第 2节实验用品的清洗 ...................... 250 一、玻璃仪器的清洗 .......................250 二、塑料器皿的清洗 .......................251 三、实验器皿的干燥与消毒 ...........251 四、常用洗涤液及其配制 ...............251 第 3节实验标本的制备 ...................... 252 一、血液样品的制备与保存 ...........252 二、尿液标本的收集与保存 ...........253 三、组织样品的制备与保存 ...........253 第 4节实验仪器的使用 ...................... 254 一、刻度吸管的使用 .......................254 二、微量进样器的使用 ...................255 三、单道可调式移液器的使用 .......256 四、蒸汽压力灭菌器的使用 ...........256 

五、酸度计的使用 ...........................256 六、干燥箱和恒温箱的使用 ...........258 七、电热恒温水浴锅的使用 ...........259 第 5节实验数据的处理 ...................... 259 一、列表法 .......................................259 二、作图法 .......................................260 三、少量实验数据的处理 ...............261 四、实验误差和提高实验准确度 的方法 .......................................261 第 6节实验报告的书写 ...................... 263 一、实验记录 ...................................263

一、一般化学试剂的分级及配制的注意事项 ...............................264二、实验室中常用酸碱的密度和浓度 ...........................................266三、常用缓冲溶液及配制方法 .......266四、溴化乙锭溶液的净化处理 .......271五、离心机转数与相对离心力的换算 ...........................................272六、硫酸铵饱和度的常用表 ...........273七、元素相对原子质量表 ...............275

二、实验报告 ...................................263参考文献 ...................................................277  第 7节常用实验数据 .......................... 264